马铃薯卷叶病毒PLRV RT LAMP检测方法优化

高彦萍 张武 王国祥 席春艳 吴雁斌 梁宏杰 吕和平

摘要 ：马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus （PLRV）是目前嚴重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一，给马铃薯产业造成巨大损失。本研究采用环介导等温核酸扩增（loop mediated isothermal amplification， LAMP）技术建立PLRV的RT LAMP检测方法。采取单因素变化试验，对RT LAMP反应体系中多个因素包括引物组合、温度条件及Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ⅰ和引物组合的浓度进行一系列试验和优化。采用RT PCR检测方法进行平行比对试验，对优化后的RT LAMP反应体系进行了验证。结果表明，最佳引物组合为P3，最适反应温度62℃，25 μL反应体系中，Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳终浓度分别为4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL，dNTPs的最佳用量为1 μL（dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L），SYBR Green Ⅰ（20×）的最佳用量1 μL，primer mix的最佳用量2.5 μL（PLRV FIP/BIP、PLRV F3/B3和PLRV LF/LB的浓度分别为0.8、0.2 μmol/L和0.6 μmol/L），RNA模板1 μL（2 ng/μL），加DEPC H2O至25 μL，反应时间50 min。优化后的RT LAMP检测结果与RT PCR一致，且可视化判读结果。因此，建立的PLRV RT LAMP检测方法为进一步开发RT LAMP检测试剂盒及其实际应用奠定了基础。

关键词 ：马铃薯卷叶病毒（PLRV）; 反转录环介导等温扩增（RT LAMP）; 检测方法

中图分类号：

S 435.32

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018484

Optimization of the PLRV RT LAMP detection method

GAO Yanping1，3， ZHANG Wu1，3， WANG Guoxiang2， XI Chunyan1， WU Yanbin1，3， LIANG Hongjie1，3， L Heping1，3

（1. Potato Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China; 2. Institute of Chinese Herbal

Medicines， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China; 3. Gansu Engineering Technology

Research Center of Potato Seed （Seedling） Virus Detection and Evaluation， Lanzhou 730070， China）

Abstract

Potato leafroll virus （PLRV） is currently one of the main threats for the yield and quality of potatoes， having caused tremendous damages to the potato industry. In this study， a PLRV reverse transcription loop mediated isothermal amplification （RT LAMP） method was established based on the loop mediated isothermal amplification （LAMP）. Single factor experiments were conducted to test and optimize the RT LAMP reaction system， including the primers， temperature， Mg2+， betaine， Bst 3.0 DNA polymerase， dNTPs， UNG， SYBR Green Ⅰ and primer mix concentrations. The optimized RT LAMP reaction system was then verified through parallel controlled test using the reverse transcription polymerase chain reaction （RT PCR） method. The results showed that， in the optimized reaction conditions， the primer pair was P3 and the reaction temperature was 62℃; in the 25 μL reaction system， the concentrations of Mg2+， betaine Bst 3.0 DNA polymerase， and UNG were 4 mmol/L， 0 mmol/L， 0.64 U/μL， and 0.08 U/μL， respectively; the dosage for dNTPs was 1 μL （0.4 mmol/L for dATP， dGTP， and dCTP， respectively， and 1.2 mmol/L for dUTP）; the dosage for SYBR Green Ⅰ（20×） was 1 μL; the dosage for the primer mix was 2.5 μL （the corresponding concentrations for PLRV FIP/BIP， PLRV F3/B3， and PLRV LF/LB was 0.8 μmol/L， 0.2 μmol/L， and 0.6 μmol/L， respectively）; for the 1 μL RNA template （2 ng/μL）， additional DEPC H2O was added to get a final 25 μL volume， and the reaction time was 50 min. The optimized RT LAMP provided the same detection result as RT PCR and the interpretation could be visualized. These results confirmed that our PLRV RT LAMP reaction system provides a basis for further developing RT LAMP detection kits and for their practical application.

Key words

Potato leafroll virus（PLRV）; RT LAMP; reaction system

馬铃薯Solanum tuberosum是世界第四大粮食作物[1]。病毒病是引起马铃薯退化的主要原因。马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus （PLRV）是目前严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一，给马铃薯产业造成巨大损失[23]。病毒检测是马铃薯病毒病害防治、预测预报、脱毒种薯（苗）培育等过程中的一个重要环节。PLRV检测主要有ELISA[4]、RT PCR[5]、多重RT PCR[6]、real time RT PCR[7]、基因芯片亦称为DNA微点阵（DNA microarray）等方法。ELISA法虽然高通量，但耗时长、程序不简便、灵敏度较低; 而RT PCR、多重RT PCR 和real time RT PCR核酸检测技术虽然具有灵敏度和特异性高以及同步性等优点，但存在仪器昂贵、成本高、专业性强，

技术难度大和成本高问题，难以在生产实际中推广应用。环介导等温核酸扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技术是Notomi等[8]2000年建立的一种的分子检测技术，该技术针对靶基因的6个特定区域设计4种特异性引物，利用DNA链置换聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温（60～65℃）条件下对靶基因进行扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速且适合于多种检测环境等优点。自开发以来，被广泛应用于许多领域的基因检测[912]。RT LAMP 技术在植物病毒检测方面亦表现出简便、快捷、准确的特点[1314]。本研究对PLRV RT LAMP反应体系中多个因子进行了优化，建立了PLRV RT LAMP检测方法，旨在为PLRV RT LAMP检测试剂盒的进一步开发及实际应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料

本试验所用PLRV阴、阳性对照是甘肃省马铃薯脱毒种薯（种苗）病毒检测及安全评价工程技术研究中心实验室保存的离体组培苗。

1.1.2 主要试剂

植物多糖多酚RNA提取试剂盒[RNAprep Pure Plant Kit（Q5613）]购自天根公司，RNasin ribonuclease inhibitor、M MLV reverse transcriptase、rTaq DNA polymerase、UNG（RNase inhibitor）、MgSO4、dNTP mix等购自TaKaRa公司，Bst 3.0 DNA polymerase 购自New England Biolabs公司，Betaine、SYBR Green Ⅰ等购自索莱宝公司，DEPC购自Vetec公司，GeneFinderTM购自至善生物公司，硝基四氮唑蓝（NBT）、琼脂糖等购自Promega公司，DAS ELISA试剂盒购自Bio Rad公司。

1.1.3 主要仪器

VORTEX GENIE2/2T漩涡混匀仪（美国SI）、iCEN 24台式高速离心机（杭州奥盛公司）、君意 JY600C电泳仪（北京君意公司）、Tanon 3500R琼脂凝胶成像系统（上海天能公司）、Nano Drop 2000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）、BIO RAD T100TM Thermal Cycler（BIO RAD）、笔式紫外灯11SC 1（Spectronics公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

已有研究表明，世界上已报道PLRV全基因序列高度同源，较其他种类病毒存在序列的保守性[7，15];PLRV的CP基因同样具有高度的同源性及核酸一致率[16]。从GenBank检索并下载PLRV的CP基因序列，通过比对获得保守区域，利用Primer Explorer V 4.0软件设计4组RT LAMP引物，经试验筛选出1组特异性引物。RT PCR采用标准SN/T 2627 2010中的引物序列[17]。引物信息见表1。引物由上海生工生物公司合成。

1.2.2 RNA的提取

使用天根公司的植物多糖多酚RNA提取试剂盒，根据试剂盒提供的步骤抽提病毒RNA总核酸，测定浓度后-80℃下保存备用。

1.2.3 RT LAMP基本体系

基本反应体系参考Bst 3.0 DNA polymerase说明书。25 μL反应体系： 2.5 μL 10×Bst buffer，1.5 μL 100 mmol/L MgSO4（10×Bst buffer中已包含20 mmol/L MgSO4），0～1.2 μL 1 mmol/L betaine，0.5～2.0 μL Bst 3.0 DNA polymerase （8 U/μL），0.5～2.0 μL dNTPs （10 mmol/L dATP、dGTP和dCTP，30 mmol/L dUTP），1～4.0 μL 10×primer mix （8 μmol/L FIP/BIP; 2 μmol/L F3/B3; 6 μmol/L Loop F/R）， 0.5～1.5 μL UNG（2 U/μL），0.5～20 μL 20×SYBR Green Ⅰ，1 ng～1 μg模板RNA，加DEPC H2O至25 μL，60～70℃孵育30 min～1 h。

1.2.4 RT LAMP检测体系优化

通过单因素变化试验分别对RT LAMP体系中的反应温度和引物浓度等条件进行优化。设置反应温度50、55、60、62.5、65、70℃，Mg2+浓度1、2、4、6、8 mmol/L，betaine浓度0、0.4、0.8、1.0、1.2 mmol/L，Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）加入量0.1、0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL，dNTPs加入量0.4、08、10、1.2、1.4、1.6 μL等（10 mmol/L dATP、dCTP和dGTP，30 mmol/L dUTP）; UNG浓度（2 U/μL），加入量0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μL，SYBR GreenⅠ（20×）加入量0.5、1.0、1.5、2.0 μL，10×primer mix（8 μmol/L FIP/BIP; 2 μmol/L F3/B3; 6 μmol/L LF/LR）加入量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，反應时间根据实时荧光PCR的扩增曲线进行判断。为了及时发现RT LAMP试验过程中的气溶胶污染，设置不加RNA模板对照（no template control，NTC）和阴性对照（negative control）。qPCR测定反应条件和主要组分不同梯度的Ct值变化，结合琼脂糖凝胶电泳扩增条带分析，确定不同因子的最佳条件或浓度。

1.2.5 RT LAMP反应体系验证

对优化的RT LAMP反应体系，采用RT PCR进行平行比对验证，RT PCR检测按标准SN/T 2627 2010[14]的改进方法进行。结果判读： RT PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析。RT LAMP扩增产物（1）反应结束后，取产物5 μL用2%琼脂糖凝胶电泳分析; （2）加入1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ，振荡混匀，直接目视观察结果，或者加入1 μL 50×SYBR Green Ⅰ，振荡混匀，紫外线下观察结果。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

用RT LAMP基本反应体系（各组分参考数值范围取中值），对设计的4组引物（P1～P4）进行筛选，反应产物琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，4组引物均能扩增出条带，其中P3组扩增条带亮度最好，故选用P3组作为体系优化的引物（图1）。

2.2 反应温度优化

利用筛选获得的引物组，设置6个反应温度梯度50、55、60、62.5、65、70℃，NTC对照和阴性对照温度62.5℃。结果显示该引物的反应温度条件较为宽松，温度55～65℃均有扩增条带，60～65℃扩增条带亮度清晰，试验体系反应温度确定为62℃（图2）。

2.3 Mg2+浓度优化

设置Mg2+浓度5个梯度1、2、4、6、8 mmol/L进行试验，NTC对照和阴性对照Mg2+浓度为4 mmol/L。结果显示RT LAMP反应在Mg2+浓度为

2～8 mmol/L 4个反应条件下均有扩增，Mg2+浓度

大于4 mmol/L，瀑布状条带清晰明显（图3），扩增曲线的Ct值随Mg2+浓度变化呈先降后升的趋势，Mg2+浓度为4 mmol/L时，Ct值最低（表2）。因此，RT LAMP检测Mg2+浓度采用4 mmol/L。

2.4 Betaine浓度优化

分别设置5个betaine浓度梯度0、0.4、0.8、1.0、1.2 mmol/L，NTC对照和阴性对照的betaine浓度为0.8 mmol/L。结果显示，RT LAMP反应在betaine浓度为0～1.2 mmol/L 5个浓度梯度下均有扩增，随betaine浓度的变化，瀑布状条带变化不明显（图4），betaine浓度为0 mmol/L 时，扩增曲线Ct值最小（表2）。因此，betaine的最佳浓度为0 mmol/L。

2.5 dNTPs浓度优化

设置6个dNTPs （dATP、dGTP和dCTP 10 mmol/L each，dUTP 30 mmol/L）浓度梯度，加入量分别为0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μL，NTC对照和阴性对照的加入量为1.0 μL。结果显示，dNTPs加入量在0.4～1.6 μL均有扩增，加入量1.0 μL时，扩增条带最亮（图5）。扩增反应的Ct值随dNTPs加入量呈先降后升的趋势，dNTPs加入量为1.0 μL时Ct值最小（表2）。因此，RT LAMP检测时dNTPs加入量采用1.0 μL（对应浓度dATP、dGTP和dCTP 0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L）。

2.6 Bst 3.0 DNA聚合酶浓度优化

设置Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）加入量为0.1、0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL，NTC对照和阴性对照的加入量为1.0 μL。结果显示，酶的加入量越多，凝胶电泳的瀑布状条带越明显。酶的加入量为0.1～0.5 μL时，有较弱的扩增，Ct值较大; 当酶的加入量为0.75～2.0 μL时，Ct值随酶加入量增大而减小，酶的加入量2.0 μL时，Ct值最小（表2）。因此，选择BST 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）的加入量为2.0 μL（对应浓度为0.64 U/μL）。

2.7 UNG浓度优化

UNG（2 U/μL），设置6种不同的浓度梯度，加入量分别为0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μL，NTC对照

和阴性对照的加入量为1.0 μL。结果显示，UNG加入量在0.5～1.25 μL有扩增，1.5 μL无扩增，在0.5～1.25 μL，Ct值随UNG加入量增加呈先降后升的趋势，UNG加入量为1 μL时Ct值最低（表2），因此，RT LAMP检测时UNG加入量为1 μL。

2.8 SYBR Green Ⅰ浓度优化

设置4个SYBR Green Ⅰ（20×）浓度，加入量分别为0.5、1.0、1.5、2.0 μL，NTC对照和阴性对照的加入量为1.0 μL。结果显示，SYBR Green Ⅰ加入量在0.5～2.0 μL时均有扩增; Ct值随SYBR Green Ⅰ加入量的增加并无显著降低，表明染料浓度在一定范围内对RT LAMP扩增反应无显著影响，加入量1 μL时Ct值相对较低（表2）。因此，RT LAMP检测时SYBR Green Ⅰ加入量为1 μL。

2.9 Primer mix浓度筛选

設置7组primer mix（10×，8 μmol/L FIP/BIP，2 μmol/L F3/B3，6 μmol/L LF/LR）浓度，加入量分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，阴性对照加入25 μL。结果显示，primer mix加入量在1.0～4.0 μL时均有扩增，在2.5～4.0 μL时扩增效率较高，但扩增Ct值差别不大，表明primer mix加入量在超过2.5 μL时达到饱和（表2）。由于primer mix加入量为2.5 μL时Ct值相对最小，因此，RT LAMP检测时primer mix加入量为2.5 μL（0.8 μmol/L PLRV FIP/BIP，02 μmol/L PLRV F3/B3，06 μmol/L PLRV LF/LB）。

2.10 RT LAMP反应体系验证

对上述优化后的RT LAMP反应体系采用RT PCR进行平行比对验证。结果表明：RT LAMP检测结果与RT PCR一致（图6a～b）。RT LAMP反应产物中加入高浓度（1 000×）SYBR Green Ⅰ后，阳性产物颜色变为绿色，NTC和阴性对照产物颜色为褐色，加入低浓度（50×）SYBR Green Ⅰ后，紫外线下（笔式紫外灯）阳性样品发出强荧光，NTC和阴性对照没有荧光（图6c～d）。因此，RT LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果，较RT PCR简单容易。

3 结论与讨论

本研究基于PLRV CP基因序列，设置了4组LAMP引物，筛选出最佳引物组P3，对反应条件及主要组分，包括反应温度、Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ⅰ和引物组合等的浓度，采用单因素变化法进行了筛选优化。从结果看出，对PLRV RT LAMP检测影响较明显的因子有引物及其浓度、Mg2+浓度、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度和UNG浓度，影响较小的因子是SYBR Green Ⅰ 浓度和反应温度。最佳引物组为P3，在25 μL反应体系中：primer mix的最佳加入量为2.5 μL （PLRV FIP/BIP、PLRV F3/B3和PLRV LF/LB的终浓度分别为0.8 μmol/L、0.2 μmol/L和0.6 μmol/L），Mg2+的最佳终浓度为4 mmol/L，Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）的最佳加入量为2 μL，dNTPs （dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L），UNG（2 U/μL）的最佳用量均是1 μL，SYBR Green Ⅰ（20×）加入量为1.0 μL，反应温度是62℃。

目前多种植物的病毒检测采用了便捷，快速、高效的RT LAMP技术，如柑橘衰退病毒[13]，葡萄A病毒、潜隐环斑病毒和轻型黄边病毒[1820]，辣椒黄脉病毒[21]，水稻多种病毒[14， 22]等。本研究实现了对马铃薯卷叶病毒RT LAMP检测方法的全面优化，对优化的检测方法采用了RT PCR标准检测方法进行平行比对验证，二者检测结果一致。而且，RT LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果），较RT PCR简单容易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要。

RT LAMP 技术采用6条引物扩增，有极高的特异性，但试验中也存在假阳性现象。主要由于其具有高的灵敏性，能检测到空气中的阳性气溶胶微粒造成[2223]。在同一地方长期操作，易在空气中形成气溶胶，操作过程中若样品混有阳性的气溶胶颗粒就易污染。本试验总结前人试验经验，严格操作规范，不同操作分区进行，反应液分装备用，保持实验室空气清洁，勤换手套和实验服，做到了有效避免气溶胶污染的发生。同时，每次试验设计空白对照和阴性对照，以便及时发现气溶胶假阳性污染和及时采取防污染措施。试验中需要开盖操作，操作周围空气中可能易形成阳性气溶胶，造成试验交叉污染;生产检测实践中，将可视化试剂1 μL SYBR Green Ⅰ在反应前滴加到PCR管盖子内侧顶部，反应结束后振荡3 s，瞬时离心5 s，然后观察结果，这样可以避免因开盖引起的气溶胶交叉污染，从而避免结果判读的假阳性。

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（责任编辑：杨明丽）