细针穿刺BRAF单基因检测在甲状腺微小乳头状癌中的诊断价值

林恩德 傅锦波 林福生 陈清贵 罗晔哲 洪晓泉 吴国洋

[摘要] 目的 探讨术前细针穿刺BRAF基因检测在甲状腺微小乳头状癌中的临床价值。方法 回顾性分析厦门大学附属中山医院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲状腺结节手术患者临床资料。其中<1 cm结节153例患者，≥1 cm甲状腺结节175例患者，根据手术后组织病理学结果，观察两组细针穿刺细胞学结果及BARF基因突变表达情况。计算细针穿刺细胞学、BRAF基因突变和两者联合诊断的敏感性、特异性及准确性，组间比较采用McNemar配对资料2检验。结果 以结节直径分为两组，<1 cm结节组中，FNAC在判断结节良恶性的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别是88.2%、95.2%、99.2%、54.1%、89.1%;BRAF基因突变检测在判断结节良恶性的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别是91.0%、100.0%、100.0%、61.8%、92.1%;≥1 cm结节组中，FNAC在判断结节良恶性的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别是88.8%、100.0%、100.0%、78.1%、94.3%;BRAF基因突变检测在判断结节良恶性的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别是77.6%、98.0%、99.0%、63.6%、83.4%。 结论 单基因检测BRAF突变在<1 cm结节中比FNAC有更好的诊断能力，是甲状腺微小乳头状癌一个可靠的诊断指标。

[关键词] 甲状腺微小乳头状癌;细针穿刺;BRAF基因突变;术前诊断

[中图分类号] R5          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）12（a）-0033-03

[Abstract] Objective To explore the diagnostic value of preoperative fine needle aspiration BRAF gene detection in thyroid micropapillary carcinoma. Methods A retrospective study was conducted on the clinical data of 328 patients with thyroid nodules who underwent surgery in the Zhongshan Hospital Xiamen University from April 2017 to December 2018. 153 patients with <1 cm nodules and 175 patients with ≥1 cm thyroid nodules were observed. The sensitivity， specificity and accuracy of FNAC， BRAF gene mutation and combined diagnosis were calculated. Results In the <1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.2%， 95.2%， 99.2%， 54.1% and 89.1% ，respectively， and the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 91.0%，100.0%， 100.0%， 61.8%， 92.1% ，respectively; In the group of ≥1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.8%， 100.0%， 100.0%， 78.1% and 94.3%， respectively; The sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 77.6%， 98.0%， 99.0%， 63.6% and 83.4%， respectively. Conclusion Single gene detection of BRAF mutation in nodules <1 cm has better diagnostic ability than FNAC.

[Key words] Thyroid micropapillary carcinoma; Fine needle aspiration; BRAF gene mutation; Preoperative diagnosis

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，在我国甲状腺癌成为近年来增长最快的恶性肿瘤之一[1]，其中甲状腺微小乳头状癌的发病率呈显著上升，主要的原因在于高频超声筛查的普及，提高了<1 cm甲状腺结节的检出率。彩色多普勒超声主要通过甲状腺结节的回声、边界、纵横比、钙化、血流情况等特征来判断良恶性。甲状腺细针穿刺细胞学（Fine needle aspiration cytology，FNAC）目前作为指南推荐的诊断甲状腺结节的“金标准”[2]，虽然有着简便、安全、可重復性高等优点，但仍受到取材质量、病理学医师个人经验等限制。该文回顾性分析厦门大学附属中山医院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲状腺结节手术患者临床资料，拟通过联合FNAC和BRAF基因检测，探讨BRAF基因对甲状腺微小乳头状癌的诊断价值，报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

方便选取该院就诊术前同时进行FNAC及BRAF基因检测的328例手术患者作为研究对象，共340枚结节。术后病理证实，144枚为甲状腺微小乳头状癌，125枚为甲状腺乳头状癌，71枚良性甲状腺结节患者。以结节直径为标准分为两组，在<1 cm组中，男性36例，女性117例，年龄18～71岁，平均（45.1±10.2）岁;≥1 cm结节组中，男性41例，女性134例，年龄8～75岁，平均（49.7±13.6）岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2  方法

1.2.1  细针穿刺方法  患者取仰卧位，颈前区皮肤消毒，铺无菌洞巾。西门子SEQOUTA型超声探查甲状腺结节，25G针头在超声引导下进入可疑结节，无负压反复提插10～15次，注射器针筒吸取4～5 mL空气将针头内的标本推至载玻片上，95%乙醇固定玻片，HE染色。再留取一针细胞样本置2 mL生理盐水的离心管中，4℃冰箱保存。

1.2.2  细胞学诊断方法  细胞涂片由同一位细胞病理学医师判读。按Bethesda分类标准将标本分为6类：标本无法判断或不满意、良性滤泡性结节、意义不明确的细胞非典型病变、滤泡性肿瘤、可疑恶性肿瘤、恶性肿瘤。该研究将可疑恶性肿瘤和恶性肿瘤归类为细胞学阳性，将其余4种定义为细胞学阴性。

1.2.3  DNA的提取及BRAF基因突变检测  3 000 g离心细胞学标本10 min，去除上清液。BRAF基因的检测采用突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法，使用人类BRAF 基因V600E突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）。设计引物，上游：5-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3;下游：5-GGC CAA AAA TTT AATCAG TGG A-3，常规反转录生成cDNA。解冻混合液，并与Taq酶、待测DNA样品以20∶0.25∶5的比例混匀，置入PCR仪进行扩增。于60℃时收集FAM 和HEX 信号。样本Ct≥28为阴性，样本Ct<28为阳性。

1.3  统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，行t检验，计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  FNAC及BRAFV600E检测结果

在269枚甲状腺乳头状癌中，有228枚存在BRAF突变。良性结节中术后病理结果55枚结节性甲状腺肿，15枚甲状腺滤泡性腺瘤，1枚慢性淋巴细胞甲状腺炎。见表1。

2.2  FNAC及BRAF基因突变检测在诊断甲状腺良恶性结节中的价值比较

将所有结节分成<1 cm结节组和≥1 cm结节组，以手术组织病理为金标准进行比较。相对于单一进行FNAC检查，FNAC联合BRAF基因突变在两组结节中的敏感度、特异度等指标均较高，差异有统计学意义（P<0.05）;在<1 cm结节组中，BRAF突变检测的敏感度、特异度及准确度均高于FNAC，差异有统计学意义（P<0.05）;而在≥1 cm结节组中，BRAF突变的敏感度、特异度及准确度均低于FNAC，差异有统计学意义（P<0.05），结果见表2、表3。

3  讨论

2014年世界卫生组织公布的数据中显示，甲状腺癌的新发病例中有50%以上是微小乳头状癌。超声引导下细针穿刺细胞学检查被认为是目前鉴别甲状腺良、恶性结节最准确的方法。小于1 cm的甲状腺结节进行细针穿刺时，结节内提插路径较短，针尖反复进出结节，同时由于“部分容积效应”，导致有效取材量不足。Moon等[3]研究了1 440个微小结节的FNAC结果，发现结节直径每减少1 mm，标本不满意率持续升高。该研究中，FNAC在<1 cm的结节里的准确度为89.1%，而在≥1 cm结节里的准确度为94.3%，显示出FNAC在甲状腺微小结节诊断中有一定的局限性。而细针穿刺标本中，约有7.5%的细针穿刺细胞学诊断为不典型细胞[4]。这部分病例可能造成外科医师的困惑，激进的诊断性手术可能会造成手术并发症及甲状腺缺失引起的甲状腺激素终身替代;保守的观察也许会导致恶性肿瘤的进展及远处转移。

BRAF基因作为RAF-MEK-ERK信号转导通路中的重要成员，在肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用。BRAF V600E基因突变在甲状腺乳头状癌中的检出率为66.2%～72.2%，与经典型和预后差直接相关[5-6]。该研究病例中有84.8%的甲状腺乳头状癌中存在BRAF突变，较以往报道较高，可能原因为该研究使用ARMS法进行BRAF基因突变检测，敏感性相对传统Sanger测序法高[7]。而该次首次提出，在<1 cm结节内，单基因BRAF突变检测有92.1%的准确度，强于FNAC的89.1%。原因在于基因检测的个人经验因素少，诊断特异性强，相比FNAC更能够提供给外科医师确凿的诊断结果。总共有23例患者（7.2%）细胞学为阴性，但因为BRAF检测为阳性，行手术治疗证实为甲状腺乳头状癌。但必须注意到，有极少数病例在良性甲状腺肿瘤中检测出BRAF突变 [8]。该研究亦有1例患者术前穿刺BRAF检测出突变，术后病理证实为结节性甲状腺肿，考虑为癌前病变可能。根据该中心的经验，在<1 cm的微小結节进行细针穿刺活检时，建议同时联合检测BRAF突变，避免患者因细胞诊断不明确而进行二次穿刺，增加诊疗时间及患者心理负担。

综上所述，单基因检测BRAF突变在<1 cm结节里体现出强于FNAC的诊断价值，可作为甲状腺微小乳头状癌的诊断可靠的分子标志物。