RNA结合蛋白Lin28在恶性肿瘤发生发展中的作用和分子机制

李亚飞 张 霄 王雪飞 翁明娇 王天真

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，其家族包括Lin28A和Lin28B两个成员[1]。Lin28A最早在线虫中被发现[2]，随后研究人员证实，在哺乳动物中也能检测到Lin28A的表达。Lin28A具有调控发育时相的作用，在胚胎干细胞中表达水平相对较高，对于维持干细胞的自我更新具有重要意义。2006年，Lin28A的同源异构体-Lin28B首次在人肝细胞癌中被鉴定出来[3]。研究证实，Lin28B在结构、功能和表达部位上与Lin28A具有很多相似之处。近些年来，大量研究证实Lin28分子在多数恶性肿瘤组织中表达上调，其作为原癌基因，在肿瘤的发生和进展过程中发挥重要推动作用[4]。然而到目前为止，Lin28参与肿瘤发生和进展的上下游调控机制尚不明确。即哪些因素诱导了Lin28的表达，同时Lin28又通过哪些路径参与了肿瘤恶性表型的调控，都有待于进一步探索。本文就现有文献进行整理，对Lin28在恶性肿瘤中的生物学作用进行了归纳，同时对其上游调控机制和下游信号路径进行了分析和总结。

1 Lin28上调对恶性肿瘤的发生和发展具有促进作用

2009年，Viswanathan等[5]首先证实Lin28具有促进正常细胞恶性转化的作用。该小组在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达了Lin28分子，结果发现细胞在软琼脂内形成克隆，并在裸鼠体内形成肿瘤，这与Lin28抑制let-7的生成密切相关。随后，King等[6]发现，Lin28B可以使结肠上皮细胞获得永生化，细胞具有软琼脂克隆形成能力，转移能力也得到显著提升。Madison等[7]还发现，Lin28B的上调能促进结肠隐窝的转化，进而形成肠息肉和腺癌。

大量研究证实，Lin28过表达具有促进肿瘤细胞增殖的作用[8-9]。Lin28可以通过激活增殖相关转录因子[10]、上调细胞周期相关因子[11]、刺激细胞增殖信号通路[12]、促进核糖体蛋白合成和增强葡萄糖代谢等提高肿瘤细胞的增殖能力[13-14]。但也有报道称，Lin28能扰乱胃癌细胞的周期进程，并诱导细胞凋亡，从而抑制癌细胞的增殖能力[14]。

转移是恶性肿瘤重要表型之一。大量证据表明，Lin28能促进多种恶性肿瘤的转移过程[15]。Lin28参与癌细胞侵袭和转移与其调节上皮-间质转化过程(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关[16]。Lin28可以通过抑制let-7家族而间接促进EMT相关基因的表达。同时作为RNA结合蛋白，Lin28可以抑制E-钙黏蛋白的翻译。另外，Lin28也可促进高迁移率族蛋白中的HMGA1表达，而HMGA1又可通过诱导Slug和Snail的表达来促进EMT发生[8]。

总之，现有的研究显示，Lin28在多种恶性肿瘤组织中表达上调。Lin28表达上调不但与细胞转化和肿瘤的发生密切相关，同时对肿瘤演进过程也有重要推动作用。

2 Lin28在肿瘤组织中表达上调的上游调控机制

近年来，研究人员已经揭示了几种调控Lin28表达增加的分子机制，主要包括转录水平和转录后水平调控。目前，已经有几种转录因子被证实可以促进Lin28的转录，如c-myc、NF-κB、STAT3、β-连环蛋白和SOX2[17-20]。这些转录因子表达上调是导致Lin28过表达的重要原因。另外，转录后调控机制也被发现调控了Lin28的表达。具体方式如下：(1)某些miRNA可以调控Lin28的表达。如let-7和miR-181，可以与Lin28的mRNA结合，抑制其翻译，因此这些miRNA下降可导致Lin28表达增加[21]；(2)某些RNA结合蛋白可以在转录后水平影响Lin28的表达，例如，锌指蛋白36(Tristetraprolin，TTP)能绑定Lin28 mRNA 3′UTR内的AU富含元件，进而导致其mRNA降解[22]。然而，TTP在肿瘤中通常下调，因此Lin28表达水平相对增加。又如，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IMP3)能绑定并增加Lin28B mRNA的稳定性，进而促进Lin28B的表达[23]；(3)RNA编辑也可能影响Lin28的产生。研究发现，Lin28 mRNA的3′-UTR中含有Alu反向重复元件，RNA腺苷脱氨酶(ADAR)可对其进行识别，并通过催化水解脱氨作用使Lin28的腺苷(A)转变为肌苷(I)，从而导致Lin28 RNA被扣留在核旁斑中而不能有效输出到细胞质内[24]。最后，Lin28的翻译后修饰可能会通过增加Lin28B稳定性而上调其水平。如在多能干细胞中，MAPK/ERK激活时，ERK可直接磷酸化Lin28而显著增强其稳定性[25]。与此同时，泛素连接酶TRIM71可通过泛素介导的蛋白酶体降解机制而诱导Lin28B的降解[26]。总之，现有的研究证实，机体可通过转录激活、翻译增强或提高稳定性等机制促进Lin28的表达。

3 Lin28促进肿瘤发生和演进的下游信号路径

作为RNA结合蛋白，Lin28可通过直接结合特定的碱基序列来调节RNA分子。Lin28有两个RNA绑定区域(Binding RNA domains，RBD)：冷休克结构域(Cold-shock domain，CSD)和锌指结构域(ZKD，或Cys-Cys-His-Cys[CCHC]型CCHCx2结构域)，可以与各种preE-let-7的前体RNA结合[27]。其中CSD与前元素(preE)中的茎-环结构结合，而ZKD与preE3′末端附近的高度保守的GGAG序列相互作用。连接两个折叠结构域的连接体是灵活的，从而适应Lin28与不同let-7家族成员的结合[27]。最近有研究人员提出了一个新的RNA二级结构模型，Lin28可以识别其中由4个鸟嘌呤构成的G四分体结构(G4)[28]。通过这些特殊的结构和序列，Lin28可以识别、绑定并调控多种RNA分子的表达，进而实现对肿瘤发生和进展的促进效应。

3.1 Lin28能调节miRNA的生成

let-7家族是最早被发现受Lin28调控的miRNA分子，研究也最为清楚。阻断let-7目前被认为是Lin28发挥生物学功能最重要的分子机制之一。Lin28可以通过CSD识别并绑定pri-let-7和pre-let-7环内的GGAG序列，阻止了Drosha和Dicer对let-7前体的加工来调节let-7 microRNA的成熟[29]。同时，Lin28的CCHC锌指结构域通过促进其降解来抑制let-7的作用：首先稳定Lin28：let-7复合物，然后通过与N-末端TUT4的直接相互作用募集TUT4，诱导pre-let-7发生寡聚化，然后由Dis3L2的聚(U)进行特异性降解Lin28[13]。此外，SET7/9可以使Lin28A发生甲基化，导致其稳定性增强并转位至核中，与pri-let-7结合限制其出核，从而抑制let-7的成熟过程[30]。研究发现，并非所有let-7家族成员都能被Lin28调节。在12种let-7成员中，人类let-7a-3逃逸了Lin28介导的抑制作用。另外，鼠同源性let-7c-2对Lin28结合的亲和力也较低，其机制与let-7c-2内的一个短小茎环结构有关，其阻止了Lin28的CSD和pre-let-7c-2环之间的相互作用[31]。

除了let-7家族外，Lin28也被发现可调节其他miRNA。如Lin28B通过GGAG序列与miR-17～92和miR-363结合，上调这些miRNA的生成[32-33]。Lin28还可通过其CSD与miR-302d前体相互作用，并抑制miR-302d的表达水平[34]。此外，Lin28也可以抑制miR-107在胃癌细胞中的表达，抑制miR-125在人肝细胞癌中的表达[35-36]。总之，Lin28可以通过CSD识别和CCHC锌指结构域来调节某些miRNA的生成，从而影响肿瘤细胞的生长。许多miRNA都是Lin28的潜在调控靶点。随着研究的深入，更多的Lin28靶miRNA将会被发现并且其机制也会越来越明确。

3.2 Lin28可以调控mRNA的翻译和稳定性

2007年，研究人员发现Lin28可以结合胰岛素样生长因子2(IGF-2)的mRNA，并通过驱动IGF-2 mRNA到核糖体而增强其翻译效率[37]。这为Lin28作为RNA结合蛋白直接结合和调节mRNA分子提供了证据。此后，一系列细胞周期调节因子等的mRNA陆续被证实为Lin28的调控靶点，Lin28可以增强它们的翻译水平[38]。在胚胎干细胞内的基因广谱研究证实，一些与生长和存活相关的mRNA是Lin28的靶基因[13]。Lin28通过将RNA解旋酶A(RHA)募集到多核糖体来增强这些基因的翻译[13]。除了对翻译的影响，Lin28也可以影响特异性mRNA的稳定性，Lin28与靶mRNA结合可以抵消Drosha依赖性mRNA的不稳定性[39]。在恶性肿瘤中，Lin28还可以直接结合原癌基因并增加其翻译，如HER2和BMP4，借以诱导细胞增殖[40-41]。然而，Lin28有时也能抑制其靶mRNA的翻译。例如，在胚胎干细胞分化过程中，Lin28可以通过结合Hmga2 3′UTR中的高度保守元件下调Hmga2的翻译[42]。

随着越来越多的mRNA被鉴定为Lin28的靶mRNA，研究人员开始分析这些mRNA中的特异绑定序列。结果发现，这些靶mRNA中都存在的一个富含GGAGA序列的环状结构，并认为这是Lin28的识别位点，而且这个识别位点在大约1/4人类转录物本中都存在，全基因组研究也发现了几个潜在的Lin28结合位点，包括GGAGA、AYYHY(Y=U，C和H=A，C，U)和AAGNNG[43]。这些研究提示，体内很多mRNA都是Lin28的潜在调控靶点。相信随着Lin28结合位点的发现，越来越多的受Lin28调控的靶mRNA将被发现。Lin28通过调控mRNA的翻译和稳定性，进一步影响肿瘤等的发生发展。

3.3 Lin28可以调控RNA剪接过程

已经有研究发现，乳腺癌中Lin28能优先结合编码剪接因子的转录本，如hnRNP F、TIA-1、FUS/TLS和TDP-43，增强其翻译并导致细胞出现广泛剪接[43]。最近，Yang等[40]通过质谱分析发现，剪接因子hnRNP A1与Lin28的表达具有相关性。然而，RIP-Seq数据显示，Lin28在hnRNP A1位点没有富集。提示Lin28可以调节乳腺癌细胞的剪接过程，但并不依赖于hnRNP A1。总之，Lin28可以通过影响剪接因子的翻译而影响癌细胞中RNA剪接过程，进而调控肿瘤的发生和演进。

3.4 Lin28可以调节基因转录

尽管是一个公认的RNA结合蛋白，但已经有研究证实，Lin28可以在转录水平调控基因表达。Zeng等[44]首次证实了Lin28A具有直接调控转录的能力，并对Lin28A的DNA结合特征做了总结。该团队进一步研究发现，Lin28A能识别活性转录泡中的DNA共有序列，并通过调节胞嘧啶修饰状态招募Tet1共同调控基因转录。尽管这一说法还没有得到充分的验证，但确实有一些证据为Lin28的此项功能提供了佐证。Hudson等[45]曾经证明，某些蛋白分子中的CSD结构可以结合单链DNA。RNA结合蛋白-剪接调节子人精氨酸/丝氨酸丰富剪接因子2(RSF2)，被证实可作为转录因子发挥作用[46]。据此，Lin28确实可能具有DNA结合能力，通过这种方式可以调节基因转录，从而影响肿瘤的发生和发展。但其具体机制尚不明确，有待进一步研究。

4 小结与展望

RNA结合蛋白Lin28已经被证实在多种人类恶性肿瘤中表达增加，具有促进肿瘤发生和进展的作用，也是肿瘤预后不良的生物学标志物。现有的研究证实，Lin28在肿瘤组织中表达上调的分子机制主要包括转录水平调控和转录后水平调控两种。如某些miRNA和RNA结合蛋白可以在转录后水平影响Lin28的表达，同时RNA编辑也可能影响Lin28的产生。作为RNA结合蛋白Lin28也可直接调节靶mRNA的转录、剪接、稳定性和翻译，进而实现对肿瘤的促进效应。Lin28对靶基因的识别依赖于特定序列，因此通过对这些特定序列的研究可以帮助我们发现更多的Lin28调控靶点，发掘Lin28的功能。另外，我们最近的研究提示，在结直肠癌中Lin28 mRNA和蛋白质的功能可能并不一致[47]。鉴于Lin28A和Lin28B的mRNA分子含有较长的3′-UTR，我们推测Lin28的mRNA分子可能具有一些新的不依赖于蛋白编码功能的作用，这个假设需要通过进一步的实验来验证。一旦被证实，将从全新角度完善Lin28分子机制。总之，Lin28是肿瘤进展的一个重要调控因子，是恶性肿瘤治疗中的重要靶点。