黄芪多糖通过Traf6/TAK1 信号通路调节视网膜神经节细胞的炎症反应

赖莉，覃晖

黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，AP）是来源于黄芪的一种活性物质，并且表现出广泛的药理活性，包括抗氧化应激、参与免疫调节、调节血糖水平及抗炎等方面[1-2]。有研究发现黄芪多糖能够抑制过氧化氢诱导的大鼠视网膜神经节细胞（RGC-5）凋亡，对RGC-5 细胞的氧化应激损伤具有保护作用[3]。然而对体外培养的视网膜神经节细胞是否具有抗炎保护作用不明确。青光眼的发病原因较为复杂，由多因素引起的一类退行性、致盲性视神经病变[4]。临床主要表现为视神经萎缩、视野损伤、视网膜神经节细胞凋亡等[5]，在导致视力丧失的眼病中位居第2位[6]，严重影响着患者的正常生活和健康。视神经的损伤会进一步导致视网膜神经节细胞（RGCs）内发生炎性损伤，引起视网膜神经节细胞原发或继发死亡。因此，本文采用体外培养RGCs 细胞构建炎性细胞模型，探讨黄芪多糖对脂多糖诱导的RGC-5 细胞炎性反应的保护作用，并初步研究其可能作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

视网膜神经节细胞（RGC-5，武汉巴菲尔生物有限公司）；黄芪多糖（陕西中鑫生物有限公司，批号：1203011）；DMEM 培养基（上海谷歌生物有限公司）、胰蛋白酶（美国Sigma 公司）；CCK-8 试剂盒购自默沙克生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海谷歌生物有限公司，批号P0012S-07）；IL-6、TNF-α 检测试剂盒购自上海华美生物有限公司；一抗稀释液（上海吉诺公司，批号：C154855）；ECL 显 色 液（Sigma 公 司）；β-actin、Traf6、TAK1 及p-TAK1 一抗（均购自美国Cell Signaling Technology）；二抗羊抗兔IgG 购自美国LI-COR Biosciences。单人超净工作台（北京六一仪器厂）；CB15C02 型细胞培养箱（北京六一仪器厂）；Victor3 1420 Multilable Counter 酶标仪（美国BD，FACS AriaIII）；HD-3000凝胶成像仪（上海上天精密仪器有限公司）；7230G数显可见紫外分光光度计测定仪（上海菁华）。

1.2 RGC-5 细胞培养

采用DMEM 完全培养基培养RGC-5 细胞，置于37℃、5% CO2的恒湿培养箱，待细胞贴壁生长至90%左右，便弃去旧培养基，用无菌PBS 清洗细胞2 次，加入胰酶进行消化，待细胞变圆后加入培养基终止消化，离心、重悬后以1:3 比例进行传代培养。

1.3 细胞增殖检测

取对数生长期的细胞消化、离心、重悬、调整密度，以1×104个/孔细胞数接种于96 孔板中持续培养24 h，弃去每孔中的培养基，加入含不同浓度黄芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干预处理24 h 后，吸干板内培养基，然后每孔加入含10 μL CCK8 试剂的无血清培养再继续孵育1 h，酶标仪于450 nm 波长处检测每孔的吸光度值。

1.4 检测炎性因子IL-6、TNF-α 水平

取对数生长期的RGC-5 细胞，清洗、消化、重悬细胞后，以5×105个/孔接种于6 孔板中，每组实验设置6 个复孔，37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。加入含不同浓度黄芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干预处理24 h 后，收集细胞上清及细胞。ELISA 试剂盒用于上清炎性因子IL-6、TNF-α 水平检测，操作步骤严格按照说明书进行。

1.5 Traf6、TAK1 和p-TAK1 蛋白表达

将收集的细胞裂解，测定蛋白浓度后，裂解液中加入上样缓冲液，100℃加热煮沸10 min。电泳时，每孔上样蛋白量为40 μg，在12%的SDS-PAGE 凝胶中电泳分离，浓缩胶电泳分离时电压设置为70 V，分离胶电泳时电压设置为120 V；分离完成后在275 mA电流转膜60 min；再将NC 膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；一抗孵育过夜后，再二抗常温下孵育1 h，洗膜3 次，显色成像。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，数据符合正态分布，两两组间比较采用方差分析中LSD-t 检验。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AP 对RGC-5 细胞相对存活率的影响

LPS 能明显抑制RGC-5 细胞的增殖，表现在LPS 诱导组细胞相对存活率（48.7±3.92）%相对于空白对照组而言显著降低，差异有统计学意义（t=7.437，P＜0.05）；经过低、中、高剂量黄芪多糖干预RGC-5细胞后，细胞增殖能力明显增强，表现在不同剂量黄芪多糖组中细胞相对存活率[低剂量（61.4±3.09）%、中剂量（72.4±2.96）%、高剂量（82.6±3.07）%]均显著高于LPS 诱导组，差异有统计学意义（t低=9.042，P＜0.05；t中=12.046，P＜0.05；t高=4.327，P＜0.05），并且随着药物浓度升高细胞相对存活率也随之增高，表现出浓度依赖性。

图1 RGC-5 细胞光学显微镜下图像

图2 AP 对视网膜神经节细胞相对存活率的影响

2.2 AP 对RGC-5 细胞上清中IL-6、TNF-α 水平的影响

LPS 能诱导RGC-5 细胞IL-6、TNF-α 的释放，表现在LPS 诱导组中细胞上清IL-6、TNF-α 水平相对于空白对照组而言显著升高，比较有统计学意义（t=11.209，P＜0.05）；经过低、中、高剂量黄芪多糖干预RGC-5 细胞后，细胞炎性因子水平明显降低，表现在不同剂量黄芪多糖组中细胞上清IL-6、TNF-α水平均显著低于LPS 诱导组，比较有统计学意义（t=9.307，P＜0.05），并且随着药物浓度升高细胞上清中IL-6、TNF-α 水平也随之降低，表现出浓度依赖性。

表1 AP 对视网膜神经节细胞炎症因子水平的影响

2.3 AP 对RGC-5 细胞Traf6/TAK1 信号通路的影响

LPS 诱导组细胞中Traf6、p-TAK1 水平相比空白对照组升高，比较有统计学意义（t=5.183，P＜0.05）；经过低、中、高剂量AP 干预RGC-5 细胞后，Traf6、p-TAK1 水平均低于LPS 诱导组，差异比较有统计学意义（t=5.603，P＜0.05），并且随着药物浓度升高细胞Traf6、p-TAK1 水平也随之降低，表现出浓度依赖性。

图3 AP 对视网膜神经节细胞Traf6/TAK1 信号通路的影响。3A Traf6 和p-TAK1 蛋白条带；3B 对Traf6 表达水平影响；3C 对p-TAK1 达水平影响。LPS：脂多糖，Traf6：肿瘤坏死因子相关受体因子6，TAK1：转化生长因子激酶1

3 讨论

视网膜是重要的光感受器官，可以感知视觉信号进一步进行处理，然而一旦出现损伤就会引起视觉障碍或者失明。视网膜神经节细胞（RGCs）为视网膜信号输出的细胞，以动作电位形式把经视网膜神经回路加工、处理、传递至视觉中枢，进一步产生正常视觉[7-8]。在多种刺激环境下，会引起视网膜氧化应激反应，激活NF-κB 信号通路，并启动下游靶基因的转录，诱导炎性因子（IL-6、TNF-α）和黏附分子相互作用，进一步造成视网膜毛细血管阻塞无灌注、内皮损伤、新生血管形成等多个病理过程[9-10]。因此，抑制视网膜神经节细胞炎症反应可以很好的保护眼部免受损伤。

中医药治疗青光眼有确切的治疗效果[11-12]。黄芪在临床上主要用于补气，主要应用于糖尿病视网膜病变及糖尿病肾病。黄芪多糖是黄芪中主要的活性物质，对心肌细胞具有较好的保护作用，还表现出清除自由基、调节免疫、改善微循环以及清除炎性因子等多方面的药理活性[1-2]。并且研究还发现黄芪多糖对周围神经损伤的功能恢复具有促进作用，早期治疗的效果更显著[13]。本研究先通过CCK8 实验观察不同浓度黄芪多糖对RGC-5 细胞药物毒性的作用，发现0.1～2.0 mg·mL-1的黄芪多糖对RGC-5 细胞的增殖活性没有明显影响，并且细胞形态也没有发生明显变化。因此，实验采用0.25、0.5、1.0 mg·mL-1的黄芪多糖处理RGC-5 细胞，进行后续实验。研究采用了LPS 体外诱导视网膜神经节细胞炎性模型，观察黄芪多糖对RGC-5 细胞炎性损伤的保护作用。结果发现黄芪多糖能明显增高RGC-5 细胞的相对存活率，并且不同剂量黄芪多糖能明显抑制炎性因子IL-6、TNF-α 的产生，且表现出浓度依赖性。

肿瘤坏死因子相关受体因子6（Traf6）属于一种衔接蛋白，可传导膜上多种受体介导的信号，其中就包括Toll/IL 受体家族介导的信号传导。LPS 刺激可引起Traf6 的泛素化，接着与转化生长因子β 活化激酶1（TAK1）作用形成复合物，进一步激活IKB激酶家族(IKB kinases,IKKs)，促使了NF-κB 向细胞核内的转移，导致炎症反应的发生，包括炎症因子IL-6 和TNF-α 水平的升高[14]。对Traf6/TAK1 信号通路进行抑制可以降低炎症因子的产生，减轻细胞的炎性损伤。Traf6 在视网膜神经节细胞损伤过程呈表达升高的趋势，可能与青光眼的发病机制相关[15]。本文研究发现黄芪多糖能明显抑制Traf6 和p-TAK1表达，降低了Traf6/TAK1 信号通路的活化，进一步降低炎症反应。综上所述，黄芪多糖可以抑制Traf6/TAK1 信号通路的活化，降低炎性因子IL-6 和TNF-α 的产生，起到抗炎的作用。