Calpain-9蛋白在结肠癌中的表达及临床意义

吴燕敏 孙洁 王左钰 陆培华 许隽颖 刘超英 吴兵

【摘要】目的 研究钙蛋白酶-9（Calpain-9）蛋白在结肠癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法 应用免疫组化方法和免疫印迹法检测72例结肠癌患者的癌组织及癌旁组织中的Calpain-9和K-ras蛋白的表达情况，分析其与结肠癌临床病理指标的相关性。结果 Calpain-9在结肠癌组织中的阳性率较正常结肠黏膜组织显著降低，而K-ras表达水平在结肠癌中显著升高（P<0.05）。结肠癌组织中Calpain-9表达与结肠癌组织学分化类型、临床分期以及远处转移有关（P<0.05），且与远处转移、K-ras表达水平呈负相关（P<0.05）。结论 Calpain-9在结肠癌中的异常表达提示其可能参与了结肠癌的发生发展。

【关键词】结肠癌;肿瘤预后;钙蛋白酶-9

中图分类号：R735.35 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.004

【Abstract】Objective To study the expression of Calpain-9 protein in colon cancer and to explore its clinical significance.Methods The expressions of Calpain-9 and K-ras protein in 72 cases of colon cancer patients and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry and immunoblotting，and their correlation with clinicopathological parameters of colon cancer was analyzed.Results The positive rate of Calpain-9 in colon cancer tissues was significantly lower than that in normal colonic mucosa tissues，while the expression level of K-ras was significantly increased in colon cancer（P<0.05）.The expression of Calpain-9 in colon cancer tissues was related to the histological differentiation type，clinical stage and metastasis of colon cancer （P<0.05）.Further analysis showed that the expression level of Calpain-9 in colon cancer tissues was negatively correlated with metastasis and K-ras expression levels（P<0.05）.Conclusion Abnormal expression of Calpain-9 in colon cancer suggests that it may be involved in the development of colon cancer.

【Key words】colon cancer;neoplasm prognosis;Calpain-9

近年來，结肠癌的发病率及死亡率在全球范围内均居高不下，尤其是在亚洲，结肠癌是导致癌症相关死亡的重要原因之一。虽然结肠癌的手术及辅助治疗技术已取得长足进步，但结肠癌患者的预后仍然很差，5年生存率低于50%[1]。缺乏早期诊断意识和有效的预防措施是结肠癌的高发病率和死亡率的关键原因[2]。肿瘤的发生与编码或非编码基因结构和表达异常有关[3]，由于肿瘤的个体差异性，患者在同一阶段可能具有不同的治疗结果[4]。因此，寻找结肠癌致病相关的新的分子标志物及机制至关重要，将为结肠癌患者的治疗提供新方向。钙蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，具有钙离子依赖性，在细胞骨架的重构、细胞的分化、信号通路的转导和细胞的死亡等多种生命过程中起着举足轻重的作用[5]。已有研究证实，钙蛋白酶-9（Calpain-9）是消化系统的特异性钙蛋白酶[6]，并且对胃肠道黏膜有着很好的保护作用[7]。然而，Calpain-9在结肠癌发生、发展中的作用及与患者预后的相关性仍不清楚，本研究通过检测结肠癌患者癌组织与其癌旁组织中Calpain-9的表达，并分析与临床病理特征的相关性，探讨Calpain-9在结肠癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月至2018年11月在无锡市某两家三级甲等医院普外科病理明确诊断为结肠癌并且已经行根治性结肠癌手术或姑息性结肠癌切除术治疗的72例患者作为研究对象，所有患者均取肿瘤组织及其配对的癌旁组织标本（需距肿瘤组织边缘≥5 cm，且病理明确没有癌细胞）。本研究通过两家医院的伦理委员会批准，并且在手术前获得患者或患者家属的签字同意。所有患者手术前皆未接受过抗肿瘤治疗（包括辅助放疗、辅助化疗和靶向治疗等）。研究对象包含男性50例，女性22例，年龄39～78岁，平均（60.52±10.16）岁。研究对象依据美国国立综合癌症网络（2010年）公布的结肠癌TNM分期标准：包括临床分期I期+Ⅱ期30例，Ⅲ期+Ⅳ期42例;无淋巴结转移（N0）23例，淋巴结转移阳性（N1～N3）49例;病理分级高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和黏液腺癌分别为18、16、29、9例。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：目前对结肠癌的诊断标准国内外还未有统一的明确规定，本研究主要根据大便隐血试验、肠镜及病理学检查、相关肿瘤指标、影像学（消化道造影、CT、MRI等）以及其他相关检查，若检查结果之间存在相互矛盾，则以肠镜病理结果为标准。排除标准：①临床病例资料或随访资料不完整;②患者于围手术期已死亡;③患者为肿瘤复发或者并发其他恶性肿瘤;④患者有重要脏器（心、肝、脾、肾等）功能障碍。

1.3 实验试剂

兔抗人Calpain-9和K-ras多克隆抗体皆采购于美国Abgent公司;免疫组织化学实验和免疫印迹实验的其他试剂皆采购于上海百信生物科技公司。

1.4 免疫组织化学法检测结肠癌及配对癌旁组织中Calpain-9阳性细胞面积

①选取患者的肿瘤组织和配对癌旁组织，大小约0.5 cm×0.5 cm;②常规方法固定、包埋、切片;③依次进行脱蜡、抗原修复;④加入一抗（兔抗人Calpain-9或K-ras多克隆抗体） 0.05 mL （1∶300），37℃恒温孵育1 h或4℃恒温过夜;⑤加入二抗0.5 mL （辣根过氧化物酶标记），室温孵育20 min;⑥依次进行二氨基联苯胺显色、复染、脱水和封片。结果判读：组织标本阳性细胞判定标准为细胞胞浆染色呈现棕色者。每张切片均选取5个高倍镜（400×）视野，并进行定量灰度扫描（Leica RX250型图像分析系统）以及采用Qwin软件进行相关分析，最后自动计算出Calpain-9阳性细胞的面积。

1.5 免疫印迹法检测结肠癌及配对癌旁组织中Calpain-9的表达水平

①分别选取患者的肿瘤组织和配对的癌旁组织，重约50 mg;②常规方法提取组织总蛋白;③采用BCA法测定样本组织中的蛋白浓度;④采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白，依次通过湿法转膜、脱脂奶粉封闭后，加入兔抗人Calpain-9或K-ras多克隆抗体50 μL（1∶400），4℃恒温过夜;⑤加入羊抗兔Ig-HRP 50 μL（1∶500），在室温下孵育2 h后，采用ECL显色，并以β-actin为内参。

1.6 统计学方法

实验数据经双人录入SPSS 20.0统计软件包，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，变量之间的相关性，采用Spearman相关分析，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结 果

2.1 结肠癌及其配对癌旁组织中Calpain-9阳性细胞的面积

与癌旁组织（6.96±0.72） 万 μm2相比较，结肠癌组织（2.11±0.22） 万 μm2中Calpain-9阳性细胞面积明显减少，差异有统计学意义 （t=54.663，P<0.001）。见图1、图2。

2.2 结肠癌及其配对癌旁组织中K-ras阳性细胞面积

与癌旁组织（2.26±0.19） 万 μm2相比较，结肠癌组织（9.01±0.87） 万 μm2中K-ras阳性细胞面积明显增多，差异有统计学意义（t=64.318，P<0.001）。见图3、图4。

2.3 结肠癌及其配对癌旁组织中Calpain-9的表达水平

与配对癌旁组织即相对灰度值（0.34±0.06）相比，结肠癌细胞中Calpain-9 相对灰度值（0.12±0.04） 的表达水平明显降低，差异有统计学意义（t=25.887，P<0.001）。见图5。

2.4 结肠癌及其配对癌旁组织中K-ras的表达水平

与配对癌旁组织即相对灰度值（0.11±0.03）相比，结肠癌细胞中K-ras的相对灰度值（0.31±0.05）表达水平明显增加，差异有统计学意义（t=29.104，P<0.001）。见图6。

2.5 Calpain-9的表达与结肠癌临床病理特征的相关性

Calpain-9表达與结肠癌组织学分化类型、临床分期以及远处转移显著相关（P<0.05）;而与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无相关性（P>0.05）。见表1。

2.6 结肠癌组织中Calpain-9表达与K-ras、临床病理特征的相关性

Spearman相关分析结果显示，结肠癌组织中Calpain-9的表达水平与远处转移、K-ras表达水平呈负相关（r=-0.383，P<0.05;r=-0.507，P<0.05），见图7、图8。而与临床分期、分化类型无关（r=0.169，P>0.05;r=0.180，P>0.05）。

3 讨 论

与其他恶性肿瘤相比，结肠癌具有高异质性、死亡率高、预后差等特点。结肠癌发生、发展涉及多种病理因素诱发，多种基因参与，多种病理过程产生（包括基因突变、原癌基因激活和抑癌基因失活）等，是一种渐进式积聚、由量变到质变的繁琐过程，而肿瘤相关标志物对恶性肿瘤的分类、治疗方案的制订和预后评估有着重要作用[8]。Ras基因是目前公认的常见原癌基因之一，其包括H-ras基因、K-ras基因以及N-ras基因三种，其中K-ras基因最容易发生基因突变[9]，并有相当多的研究表明K-ras突变是结肠癌致病及远处转移的重要病因[10]。

本研究应用免疫组化法对72例结肠癌患者癌组织和配对癌旁正常组织黏膜中Calpain-9、K-ras表达水平进行了测定，结果显示与癌旁正常组织相比，结肠癌组织中Calpain-9的表达水平明显降低，此结果与田文武等的研究结果一致[11];而K-ras 的表达水平显著升高，并且经Spearman相关分析结果提示，Calpain-9表达水平与K-ras表达水平呈负相关。Taniguchi 等[12]研究发现，K-Ras基因的激活直接参与了结肠癌的发生、发展，且对结肠癌预后的判断有着重要作用[13]。早有相关报道称，Calpain的蛋白酶小亚基1可以和RasGAP-SH3结合以形成capn4/RasGAP-SH3，而后者在Ras基因致癌信号通路的转导中起着不可或缺的作用[14]。由以上结果推测，Calpain-9在细胞内表达的减少引起capn4/RasGAP-SH3下降，进而致使K-ras依赖的MAPK致癌信号通路的启动，有可能为结肠癌发生、发展、转移的相关机制之一。

本研究亦对Calpain-9在结肠癌患者中的表达是否与性别、年龄、肿瘤直径大小、不同临床分期、有无淋巴结转移、病理类别分级以及有无远处转移等有关因素进行了探讨，以期进一步阐明Calpain-9的表达水平与结肠癌不同病理特点间的相关性。结果显示，Calpain-9的表达水平虽与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤直径大小和有无淋巴结转移间不存在统计学差异，但与结肠癌的病理类别分级、不同临床分期、有无远处转移存在统计学差异;进一步进行Spearman相关分析发现结肠癌组织中Calpain-9的表达水平和远处转移、K-ras表达水平呈负相关。由此推测，Calpain-9可能是一种潜在的评估结肠癌转移的分子标志物。本研究纳入研究的患者临床资料完整，可信度较高，但亦存在样本量有限等不足之处，有待于增加样本量及相关动物实验进一步验证。

综上所述，Calpain-9可能参与了结肠癌的发生、发展和肿瘤迁移过程，将有可能作为评判结肠癌发生发展的新的肿瘤标志物，为结肠癌的临床治疗提供新的思路。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-10-24 修回日期：2019-11-18）

（编辑：梁明佩）