枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化研究

张宇军，曹 慧，徐 斐，袁 敏，叶 泰，于劲松

（上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093）

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶可裂解蛋白质中亮氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸形成的肽键，是温和的蛋白质水解内切酶，具有催化效率高、专一性强及污染低等优点。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶已经在食品和生物制品行业中得到广泛的应用。但传统的游离酶存在成本高、不稳定及难回收等缺陷，这些缺陷在很大程度上限制了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的应用[1-2]。由于固定化酶比传统的自由酶更有优势，所以固定化酶的固定化技术[3-5]引起化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域研究者的高度重视，经过近几十年的研究，不仅提升了特性而且拓展了应用领域[6-10]。因而，很多研究将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定于载体之上，制成固定化酶，从而有效解决游离酶成本高及不稳定等问题。固定化载体的开发也日新月异，逐渐在生产中发挥不可替代的作用[11-14]。

本课题组在前期的研究中采用CASTp 蛋白表面三维结构计算平台确定了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的亲和配基结合区域，该区域由SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407和ASP-408 组成，且位于活性区域的背面。再通过AutoDock Vina 和AutoDock 4.2 分子对接软件从Zinc 数据库中筛选出了对该结合区域有特异性结合能力的小分子配基[15-17]。经过两轮筛选，发现葡萄糖酸冼必泰对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶有较大的亲和力，其结合能达到-12.96 kcal/mol。因此，在前期实验的基础上，采用酰胺交联法将葡萄糖酸冼必泰偶联到弱酸性阳离子交换树脂上，制成亲和载体，再进一步将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶偶联到亲和载体上，制备出固定化酶，并对其酶学性质进行研究。与传统方法相比，由该方法制备的亲和载体对酶的亲和力更高，酶的活性区域也得以充分暴露，因而具有稳定性好、催化效率高及操作简单等优点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，湖北盛天恒创生物科技责任有限公司；丙烯酸型DIAION WK40 树脂，北京绿百草科技有限公司；干酪素，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖酸冼必泰，美国Alfa-Aesar公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），2-（N-吗啉）乙磺酸（MES），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

酶反应器，自制；PHS-3E 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-6000 PC 型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；KW-1000DB 水浴恒温振荡器，金坛市科析仪器有限公司；EYELA A-3S 水流抽气机，上海爱明仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 弱酸性阳离子交换树脂的预处理 将弱酸性阳离子交换树脂置于70 ℃双蒸水中搅拌清洗3次；按照1∶1.5 的比例在树脂中加入一定体积0.55 mol/L 的盐酸溶液，置于30 ℃，150 r/min 的水浴中振荡45 min，反应完毕后用蒸馏水将树脂冲洗至中性；再按照上述步骤，依次采用相同浓度的氢氧化钠和盐酸进行处理；将预处理过的弱酸性阳离子交换树脂置于双蒸水中备用。

1.3.2 弱酸性阳离子交换树脂交换通量的测定称取三份弱酸性阳离子交换树脂，分别置于干燥的具塞三角烧瓶中，向每个三角烧瓶中加入100 mL、0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液，摇匀，将瓶盖盖严，放至在60 ℃水浴锅中反应2 h，反应完毕后取出，冷却至室温。从具塞三角烧瓶中取出25 mL 反应液（不得吸出树脂颗粒）置于三角烧瓶中，再加入50 mL 双蒸水和3 滴酚酞指示剂。用0.1 mol/L 的盐酸标准滴定反应液至微紫红色，且保持15 s 不褪色，即为终点，同时进行空白试验。计算弱酸性阳离子交换树脂的交换通量为

式中：Qt为弱酸性阳离子交换树脂的交换通量，mmol/g；V1，V2分别为空白组和实验组消耗的盐酸标准溶液的体积，mL；CHCL为盐酸标准溶液的浓度，mol/L；M 为弱酸性阳离子交换树脂的质量，g。

1.3.3 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力测定

1）游离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶酶活力的测定 酪氨酸标准曲线的建立：称取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1 g，用60 mL、0.1 mol/L 盐酸溶解后定容至100 mL，即得1 mg/mL 酪氨酸母液。取酪氨酸母液，配成不同浓度的标准溶液（10，20，30，40，50 μg/mL），并于波长275 nm 处测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制出标准曲线。

枯草芽孢杆菌蛋白酶酶活力的测定：将10 mg枯草芽孢杆菌中性蛋白酶溶于100 mL、0.02 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 7.5）中，各取2 mL 酶液和酪蛋白溶液，混匀，并在30 ℃条件下反应10 min，加入4.00 mL 三氯乙酸，静止过滤，取滤液于波长275 nm处测定其吸光值为

式中：X 为酶活力，U/g（U/mL）；A 为吸光值；K 为吸光常数；4 为反应总体积，mL；10 为反应时间10 min；n 为稀释倍数；E 为紫外法与福林法的换算系数，取0.5。

2）固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶酶活力的测定 取0.05 g 左右的固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，将其置于2 mL 的磷酸缓冲溶液（0.02 mol/L，pH 7.5）中；再向其中添加2mL 酪蛋白溶液，在30℃下反应10 min，加入4.00 mL 三氯乙酸，静止过滤，取滤液于波长275 nm 处测定其吸光值为

式中：X 为酶活力，U/g 树脂；M 为固定化酶质量，g；其他同上。

1.3.4 葡萄糖酸冼必泰在载体上的修饰及表征

1）葡萄糖酸冼必泰在载体表面的修饰 将6 g预处理好的弱酸性阳离子交换树脂载体加入到30 mL 含有10.00 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和4.00 g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）缓冲溶液中（0.1 mol/L，pH 6.0），并在25 ℃条件下搅拌活化0.5 h。活化完毕后，以蒸馏水清洗树脂，直至上清液无紫外吸收，再抽干活化载体中的残余水分；在活化的载体中加入6.5 mL、0.725 mmol/L 的葡萄糖酸冼必泰溶夜，并在25 ℃、140 r/min 的恒温振荡水浴中反应12 h。反应完毕后，采用蒸馏水洗去未交联的葡萄糖酸冼必泰，直至上清液无紫外吸收，即获得修饰有葡萄糖酸冼必泰的亲和载体。

在上述实验条件下，考察葡萄糖酸冼必泰添加量（0.095、0.181、0.362、0.725、1.45、2.9 mmol/L）、载体活化时间（0.25、0.5、1、2 h）及载体羧基与EDC 摩尔比例（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响。

2）修饰有葡萄糖酸冼必泰的载体表征 葡萄糖酸冼必泰修饰量的测定：树脂活化反应完成后取上清液，利用紫外分光光度法测定上清液中葡萄糖酸冼必泰的浓度，并根据反应前后的浓度差计算葡萄糖酸冼必泰的修饰量。

傅立叶变换红外光谱：取适量冷冻干燥后的空白树脂和修饰有葡萄糖酸冼必泰的亲和载体，分别与溴化钾一起置于玛瑙研钵中，研磨成粉后装样压片。采用红外光谱仪在500～4 000 cm-1区间内对样品进行扫描，获得傅立叶红外光谱图。

1.3.5 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在亲和载体上的固定及表征 配置600 μ0/mL 的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶液，添加到15 mL 含有1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的交联溶液中，混合均匀。将溶液置于25 ℃，110 r/min 的恒温振荡器中反应1 h，再加入0.5 g 修饰葡萄糖酸冼必泰的亲和载体，继续振荡反应12h。采用蒸馏水分别洗去未交联的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、EDC 和NHS，即得固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。

在上述实验条件下，研究加酶量（75、150、300、600、900、1 200、1 500 U），EDC添加量（3.4、6.8、13.7、27.4、54.8、137 mg）对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响。

傅立叶变换红外光谱：取适量游离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，分别与溴化钾一起置于玛瑙研钵中，研磨成粉后装样压片。采用红外光谱仪在500～4 000 cm-1区间内对样品进行扫描，获得傅立叶红外光谱。

1.3.6 固定化酶、游离酶及随意固定化酶米氏常数（Km）的测定 配置浓度为0.1%、0.125%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的酪蛋白底物溶液。分别测定固定化酶、游离酶和随意固定化酶在各底物浓度下的反应初速度。按照Lineweaver-Burk 双倒数法作图原理，测出这几种酶的Km 值。

随意固定化酶的制备工艺：称取0.5 g 预处理好的弱酸性阳离子交换树脂，将其加入到15 mL、400 μg/mL 的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶液中，在25℃，110 r/min 水浴振荡器中反应12 h。反应完成后，以蒸馏水洗去未吸附的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得随意固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。

2 结果与分析

2.1 弱酸性阳离子交换树脂的交换通量的确定

采用酸滴定方法对弱酸性阳离子交换树脂的交换通量进行了测定。结果表明，弱酸性阳离子交换树脂的交换通量为2.9 mM/g 树脂，即每克弱酸性阳离子交换树脂含有2.9 mmol 的羧基。

2.2 葡萄糖酸冼必泰在载体上的修饰

2.2.1 葡萄糖酸冼必泰添加量对亲和载体修饰量及固定化酶活的影响 在载体羧基与EDC 的摩尔比例为1∶3，载体活化时间为0.5 h，加酶量为900 U的条件下，考察了葡萄糖酸冼必泰添加量（0.095、0.181、0.362、0.725、1.45、2.9 mmol/L）对其在载体上的修饰量及固定化酶活力的影响。结果见图1。

图1 葡萄糖酸冼必泰添加量对载体配基修饰量及枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响Fig.1 Effects of Chlorhexidine concentration on ligands modify quantity of the carrier and the activity of oriented neutral protease

由图1 可知，随着葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，载体上葡萄糖酸冼必泰的修饰量也随之增加。当葡萄糖酸冼必泰的添加量达到3 mmol/L 时，载体上配基修饰量达到最大，为165 μg/g 树脂。随着葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，固定化酶酶活力呈减小的趋势，当葡萄糖酸冼必泰添加量为0.095 mmol时，即载体上修饰的配基量为42 μmol/g 时，固定化酶酶活力最大，达到314 U/g 数脂。葡萄糖酸冼必泰的添加量与其固定的酶分子量并不成正比，这可能是由于随着葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，载体上葡萄糖酸冼必泰的修饰量相应增大，过量修饰的配基反而形成空间位阻，使枯草芽孢杆菌中性蛋白酶不能充分与亲和载体交联，从而降低了酶活力。因此选取葡萄糖酸冼必泰的添加量为0.095 mmol。

2.2.2 载体活化时间对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响 在葡萄糖酸冼必泰添加量0.095 mmol/L，载体羧基与EDC 摩尔比为1∶3，加酶量900 U 的条件下。考察了载体活化时间（0.25、0.5、1、2 h）对其在载体上的修饰量及固定化酶活力的影响。结果如图2 所示。

图2 载体活化时间对载体配基修饰量及固定化效果的影响Fig.2 Effects of activation time on ligands modify quantity of the carrier and the activity of immobilizated neutral protease

由图2 可知，随着载体活化时间的增加，载体上葡萄糖酸冼必泰修饰量也随之增加；当载体活化时间为2 h 时，葡萄糖酸冼必泰在载体上的修饰量达到最大，为52 μg/g 树脂。随着载体活化时间的增加，固定化酶活力呈先增加后减小的趋势。当载体活化时间为1 h 时，固定化酶酶活力达到最大，为364 U/g 树脂。载体的活化时间与其固定的酶分子量并不成正比。这是由于随着活化时间的增加，载体羧基活化生成的酯被水解，导致交联的酶分子量下降[18]。因此选取树脂活化时间为1 h。

2.2.3 载体羧基与EDC 摩尔比对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响 在葡萄糖酸冼必泰添加量0.095 mmol/L，载体树脂活化时间1 h，加酶量900 U 的条件下，考察载体羧基与EDC 摩尔比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4）对其在载体上的修饰量及固定化酶活力的影响。结果如图3 所示。

由图3 可见，随着EDC 与载体羧基摩尔比例的增加，载体上葡萄糖酸冼必泰的修饰量也随之增加；随着EDC 与载体羧基摩尔比例的进一步增加，葡萄糖酸冼必泰的修饰量呈平稳的趋势；当载体羧基与EDC 摩尔比为1∶4 时，载体上修饰的配基量达到最大，为46 μg/g 树脂。随着载体羧基与EDC 摩尔比例的增加，固定化酶活力呈先增加后减小的趋势。在载体羧基与EDC 摩尔比为1∶3 时固定化酶活力最大，达到364 U/g 树脂。这是由于当EDC 浓度较低时，活化的葡萄糖酸冼必泰较少，载体上固定化酶的量也较少；随着EDC 浓度的增加，活化的葡萄糖酸冼必泰也随之增加，为中性蛋白酶的固定提供了较多的结合位点；随着EDC 浓度的进一步增加，过量活化的葡萄糖酸冼必泰会使大量的酶结合在载体表面，酶分子之间相互挤压，导致酶的活性位点被覆盖，从而降低了固定化酶活力。因此选择载体羧基与EDC 摩尔比为1∶3。

图3 载体羧基与EDC 摩尔比对载体配基修饰量及枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响Fig.3 Effects of activation proportion on ligands modify quantity of the carrier and the activity of immobilizated neutral protease

2.2.4 葡萄糖酸冼必泰修饰载体的傅立叶红外图谱 采用傅立叶红外波谱仪对葡萄糖酸冼必泰修饰的亲和载体与空白树脂的结构进行了表征，结果如图4 所示。

图4 亲和载体和空白载体的红外图谱Fig.4 Infrared spectrogram of affinity resin carrier and resin carrier

由图4 可见，在空白载体红外图谱中的1 711 cm-1处出现了羧酸C=O 的伸缩振动峰，当载体修饰上葡萄糖酸冼必泰后，其峰消失，说明载体中的羧基与葡萄糖酸冼必泰之间发生了酰胺化交联反应。此外，在亲和载体红外图谱中的1 633 cm-1处出现了酰胺II 带的N-H 变形振动峰，3 292 cm-1处出现了仲胺反对称伸缩振动峰，同时在亲和载体红外图谱中的2 941 cm-1处出现了较强的-CH2振动峰，说明亲和树脂上引入了氨基和甲基，即葡萄糖酸冼必泰已修饰在载体上。

2.3 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在亲和载体上的固定

2.3.1 加酶量对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响 在EDC 添加量为137 mg，NHS 添加量为49.3 mg 的条件下，考察不同加酶量（75、150、300、600、900、1 200、1 500 U）对固定化酶活力的影响。结果如图5 所示。可知，随着枯草芽孢杆菌中性蛋白酶添加量的增加，固定化酶的活力呈先增加后略微减小的趋势，这是由于当载体的载酶量达到一定程度后，再增加给酶量反而会增加固定化酶分子之间的拥挤程度，使之与底物结合时的空间位阻增大，造成固定化酶活力的降低。当枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的添加量为600 U 时，固定化酶酶活力最大，达到380 U/g 数脂，因此选择600 U 作为最适的酶添加量。

图5 酶添加量对固定化效果的影响Fig.5 Effects of enzyme concentration on the activity of immobilizated neutral protease

2.3.2 EDC 添加量对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶固定化效果的影响 在加酶量为600 U（15 mL 400 μg/mL ），NHS 添加量为49.3 mg 的条件下，考察不同EDC 添加量（3.4，6.8，13.7，27.4，54.8，137 mg）对固定化酶活力的影响。结果如图6 所示。

由图6 可知，随着EDC 添加量的增加，固定化酶酶活力呈先增加后略微减小的趋势。当EDC 添加量达到13.7 mg 时，固定化酶的活力达到最大，为398 U/g。这是由于当EDC 添加量达到一定程度后，再增加EDC 的量反而会抑制枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活力，导致固定化酶活力降低。因此选取EDC 添加量为13.7 mg 为最佳水平。

图6 E DC 添加量对固定化效果的影响Fig.6 Effects of EDC concentration on the activity of immobilizated neutral protease

2.4 枯草芽孢杆菌中心蛋白酶的傅立叶红外分析

通过傅立叶红外光谱仪测定固定化酶、游离酶及修饰配基的亲和树脂载体的傅立叶红外图谱，结果如图7 所示。

图7 固定化酶、游离酶和亲和载体的傅立叶红外图谱Fig.7 Infrared spectrogram of oriented immobilized neutral protease，free neutral protease and affinity carrier

由图7 可见，固定化酶、游离酶及亲和载体的红外图谱在3 290 cm-1处都有N-H 的伸缩振动吸收峰，说明三者都含有氨基。其中亲和载体N-H 伸缩振动峰最强，表明亲和载体上具有最多的氨基，但随着亲和载体的氨基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的羧基之间酰胺化反应的进行，亲和载体上所含氨基减少。固定化酶及亲和载体的红外图谱在1 633 cm-1处有酰胺II 带（N-H 变形振动峰），且固定化酶在此处的振动频率更强，而游离酶红外图谱在此没有振动峰，说明酶分子与亲和载体之间发生酰胺化交联反应。固定化酶及亲和载体在红外图谱1 547 cm-1处都有仲酰胺II 带（N-H 的弯曲振动）峰，且振动频率不同，而游离酶无此振动峰，说明枯草芽孢杆菌中性蛋白酶与修饰小分子配基的亲和载体发生反应[19]。

2.5 固定化酶及游离酶的米氏常数

Km值是酶的特征常数，可以用来表示酶的专一性以及与底物的亲和性，因而本研究根据米氏方程，采用Lineweaver-Burk 双倒数作图法测定了固定化酶、游离酶及随意固定化酶的米氏常数。结果表明，固定化酶、游离酶及随意固定化酶的Km值分别为2.9、1.7、7.1 mg/mL。根据文献，以传统方法制备的固定化酶的Km值通常会增加1.3～4.3 倍[20-22]。在本研究中，Km值仅增加了1.70 倍，表明该固定化方法对中性蛋白酶的构象和活性位点几乎没有影响，酶对底物蛋白具有较高的亲和力。而随意固定化酶的Km值为7.1，比游离酶高约4.18 倍。随意固定化酶与底物亲和力的降低可能是由于酶构象发生了变化，活性位点形成的空间位阻对溶质分子的转运产生了阻力。

3 结语

采用酰胺化偶联方法将葡萄糖酸冼必泰修饰到弱酸性阳离子载体上，再将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶交联在亲和载体上以制备固定化酶。以固定化酶活力为指标，确定了固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的最佳制备工艺：葡萄糖酸冼必泰添加量为0.095 mmol/L，载体羧基：EDC（摩尔比）为1∶3，载体活化时间为1 h，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶添加量为600 U，酶活化EDC 添加量13.7 mg。傅立叶红外光谱结果表明，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶已经成功偶联到葡萄糖酸冼必泰修饰的亲和载体上。采用该法制备的固定化酶的Km值为2.9 mg/mL，表明其与底物具有较高的亲和力。