RNAi 靶向沉默opaque2 基因对高粱醇溶蛋白含量的影响

2019-02-06蔡欣月李志江牛江帅孙艺墨戴凌燕

食品与生物技术学报 2019年10期

蔡欣月，李志江，牛江帅，包丹，苏晨，孙艺墨，戴凌燕*

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是世界主要粮食作物之一，也可作为动物饲料，在世界发达及发展中国家种植面积较大，广泛分布在亚、非和美洲等热带干旱、半干旱地区。在中国，高粱年均种植面积约为722 400 hm2，产量可达2 865 000 万t，为世界第四大高粱主产国[1]。高粱可在干旱边际土地上种植，不与玉米、小麦和水稻争夺农业用地。因此，随着世界总人口不断增加，极端气候频繁出现，可利用水资源日渐减少，土地盐渍化逐年加剧，高粱作为抗旱耐逆的经济作物，必将在农牧业生产中占有重要战略地位。

高粱籽粒包含淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素和少量的灰分及蜡质。蛋白质约含6.8%～19.6%，是高粱中除淀粉以外含量最多的成分[2]。但是，高粱蛋白富含半胱氨酸，缺乏人体必需的赖氨酸和色氨酸，在禾谷类作物中消化率最低，约为30%～80%[3]，且会导致以高粱为主要蛋白食物的人严重营养不良[4]。高粱的主要贮藏蛋白为醇溶蛋白，约占高粱总蛋白的77%～82%[5]，根据蛋白质分子量和氨基酸序列组成被分成α、β、γ 和δ 醇溶蛋白，与玉米相似[6-7]。而α-醇溶蛋白占高粱醇溶蛋白总量的66%～84%[8]。而转录因子Opaque2（O2）可通过识别启动子上O2 box（TCCACGT）来调控玉米22 kDa α-醇溶蛋白和15 kDa β-醇溶蛋白的基因表达[9-10]，O2 基因的突变能降低α-醇溶蛋白的含量，在有的玉米近交品系中α-醇溶蛋白能减少60%以上[11]，并会增加富含赖氨酸和酪氨酸蛋白质的积累[12]。随着社会和经济的发展，人们追求高生活品质的同时很注重保健。在食物方面更青睐营养价值高，有益于健康的粗粮食材，而高粱产品从古至今一直被人们所喜爱。因此，有望在高粱醇溶蛋白合成调控基础上，通过生物技术遗传转化改良高粱蛋白质的营养品质。

目前为止，高粱育种主要集中在增加产量、提高抗性和降低单宁等方面，而在降低醇溶蛋白含量方面罕见报道。众所周知，传统育种针对性较差、分子机制不清楚、且费时耗力，收效小；而通过生物技术进行遗传转化可省时，收效大。近年产生的新技术RNA 干扰（RNA interference，RNAi）介导的基因沉默具有特异、高效的特点，植物中运用转基因技术所形成的RNAi 可以遗传到下一代。本研究将构建的opaque2 基因RNA 抑制表达载体利用农杆菌介导转化高粱幼胚，通过测定转基因植株籽粒中醇溶蛋白含量，观察胚乳中蛋白质体形状变化，以及SDS-PAGE 电泳检测等来分析RNAi 靶向沉默opaque2 基因对高粱醇溶蛋白含量的影响。以期筛选出籽粒中醇溶蛋白含量低的优质株系，为扩展高粱的遗传基础和加快高粱品质育种进程提供种质资源和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高粱品种P898012 由美国密苏里大学哥伦比亚分校遗传转化中心张展元实验室惠赠；高粱组织培养中激素类IAA、6-BA 和IBA 均购自美国Sigma公司；头孢噻肟购自美国Caisson 公司；草铵膦购自美国Sigma 公司；限制性内切酶BamHI、SpeI、KpnI、SacI、HindIII 和EcoRI，T4 DNA连接酶，Taq 聚合酶，载体T-Vector pMD20 等购自宝生物工程有限公司（大连）；PCR 产物纯化和质粒提取等试剂盒均购自天根生化科技有限公司（北京）；TRIZOL 购自美国invitrogen 公司；所有引物均由上海生工公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 RNAi 抑制表达载体构建以GenBank 核酸数据库中高粱opaque2 基因序列（登录号X71636）上第1 个外显子设计引物。一对引物带有BamHI和SpeI 酶切位点；另一对带有KpnI 和SacI 酶切位点。将2 个扩增目的片段分别连接到植物载体p130035SI-X 上，然后再用HindIII 和EcoRI 将带有35S、目标片段和NOS 片段切下后连接到pCambia3300 载体上，用筛选抗性草铵磷（Bar）基因替换掉潮霉素（hptII）基因。

1.2.2 高粱幼胚遗传转化高粱幼胚的遗传转化体系参照Do 等的方法进行[13]。取授粉11～14 d 高粱籽粒，经消毒后剥离幼胚作为外植体。将opaque2 基因的RNAi 抑制表达载体转入农杆菌AGL1 中，利用农杆菌介导转化高粱幼胚，通过诱导愈伤、草铵磷抗性筛选芽分化、根分化过程来获得再生转基因植株。

1.2.3 再生植株的阳性检测与分析

1）再生植株的PCR 检测。再生植株先通过叶片涂抹草铵磷溶液来进行初步筛选，若叶片涂抹处未变黄焦枯，则初步认定其为阳性转基因植株。然后提取叶片DNA，使用Bar 基因和载体上序列设计引物进行PCR 检测确定。构建载体及再生植株阳性检测的引物见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2）转基因植株实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。取叶片检测呈阳性植株开花20 d 的籽粒，用Trizol 试剂盒分别提取胚乳总RNA，依据产品说明书，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒进行反转录。以高粱actin 基因为内参（扩增引物为actin-F：TTGGGTCAGAAA GGTTCAGG 和actin-R：TGCTCATTCGATCAGCAAT C），以opaque2 基因序列设计引物（o2-F：CAAGCTG AAGAGCCAACCAT 和o2-R：AGAGTTGATCCGGA GGAGGT），利用SYBR 荧光染料法进行qRT-PCR检测，并分析opaque2 基因的相对表达量。

1.2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量测定及SDS-PAGE电泳高粱籽粒中醇溶蛋白含量测定参照文献[14]。各转基因植株收获籽粒后，随机取20 粒烘干至恒重后，研磨至粉末状。称取高粱籽粒粉末50 mg加到2.0 mL 离心管中，按1∶10 比例（g/mL）加入含4% DDT 的60%叔丁醇提取液500 μL，混匀后在37℃水浴过夜提取，8 000 r/min 离心15 min，取上清测定醇溶蛋白含量。蛋白含量测定采用考马斯亮兰G-250 方法。高粱籽粒醇溶蛋白SDS-PAGE 电泳参照Hamaker 的方法进行[15]，略有修改。取300 μL 提取液减压蒸发溶剂，使蛋白质沉淀。加入100 μL 5X电泳上样缓冲液（不含溴酚蓝）溶解蛋白质。取10 μL 溶解蛋白样品与10 μL 的含有溴酚蓝的5X 电泳上样缓冲液混合后沸水浴处理5 min，取15 μL样品用15%的分离胶电泳检测。

1.2.5 高粱籽粒透射电镜观察高粱籽粒用2.5%戊二醛在4 ℃固定，PBS 缓冲液冲洗3 次。1%锇酸在4 ℃后固定2 h，仍用PBS 缓冲液冲洗3 次。使用30%、50%、70%、90%和100%系列的乙醇梯度脱水，每次10 min，100%乙醇梯度脱水2 次。然后用Epon812 环氧树脂包埋，在37、45 ℃和65 ℃温箱固化，各级温度固化24 h。经UltracutE 超薄切片机切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色后，用日立H-7560 透射电子显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 构建RNAi 抑制表达载体

RNAi 抑制表达载体构建过程如图1 所示。用高粱opaque2 基因序列第1 个外显子上带有BamHI和SpeI 酶切位点，KpnI 和SacI 酶切位点的两对引物进行RT-PCR，分别扩增出2 条长度约为224 bp的目标片段（图1（a））。在将2 条目标片段1 正1 反分别连接到植物载体p130035SI-X 上后，用BamHI和SacI 2 个内切酶酶切载体进行验证。由于载体上连接的2 条目标序列间还存在1 个118 bp 长度的内含子，在酶切后产生除线性载体外的一个约566 bp 的短片段（图1（b））。由于载体p130035SI-X 上的植物抗性筛选基因为hptII 基因，其不利于高粱抗性植株的筛选。因此，使用HindIII 和EcoRI 将新构建的p130035SI-X 载体上带有35S 启动子、目标片段和 NOS 终止子片段切下后连接到pCambia3300 载体上，用筛选抗性Bar 基因替换掉hptII 基因。用HindIII 和EcoRI 2 个内切酶酶切新构建的pCambia3300 载体进行验证，产生除线性载体外的一个约1 700 bp 的片段（图1（c）），结果表明带有opaque2 基因片段的RNAi 抑制表达载体构建成功。

图1 RNAi 载体构建电泳Fig.1 Electrophoregram of RNAi vector construction

2.2 农杆菌介导opaque2 基因RNAi 抑制表达载体转化高粱

以高粱幼胚为外植体，利用农杆菌将opaque2基因RNAi 抑制表达载体转化高粱品种P898012 的过程如图2 所示。农杆菌转化幼胚共培养3 d 后，幼胚长大并在胚周围产生色素（图2（a））。在草铵磷抗性筛选培养基上，抗性愈伤白色致密，而非抗性愈伤则水浸状褐色，甚至变黑（图2（b））。在诱导芽分化的草铵磷抗性筛选培养基上，抗性愈伤组织可先后分化出从生苗，而有些愈伤则变黑坏死（图2（c））。将苗转移到生根培养基上诱导生根（图2（d））后，移苗至土中。

图2 高粱遗传转化Fig.2 Genetic transformation of sorghum

2.3 阳性转基因植株检测与分析

2.3.1 转基因植株的PCR 检测再生幼苗叶片涂抹100 mg/L 草铵磷，若涂抹叶片在3 片以上未发生黄褐色焦枯，则初步认为其为阳性植株。取叶片提取DNA，用Bar 基因引物以叶片DNA 为模板进行PCR 扩增，目标片段约为552 bp，结果见图3（a），野生型植株未扩增出目标条带，而有些转基因植株可扩增出目标条带。再用载体上两个插入片段间内含子设计的上游引物，和在其后载体上设计的下游引物，以DNA 为模板进行PCR 扩增，目标片段约为591 bp，结果见图3（b）。可见，在pCambia3300 载体上扩增出极亮目标条带，而在以H2O 为模板的阴性对照和野生型植株中均未扩出目标条带；有些转基因植株可扩增出目标条带。经过多次检测，将用不同引物可同时扩增出相应目标条带的植株确定为转基因植株，本试验共获得5 株。

2.3.2 转基因植株的qRT-PCR 检测分析以高粱actin 基因为内参，采用qRT-PCR 对高粱胚乳中opaque2 基因的表达量进行检测，见图4。结果表明，除1 号外，其余4 株转基因植株中opaque2 基因的表达量较对照显著降低（P＜0.05），但不同植株表现不同，12 号下降程度更大。可见，通过RNAi 技术可对转基因高粱植株opaque2 基因造成不同程度的干扰。

图3 阳性植株检测电泳图Fig.3 Electrophoregram of detecting the positive plants

2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量测定及SDS-PAGE电泳

2.4.1 籽粒中醇溶蛋白含量测定 RNAi 抑制opaque2 转基因高粱籽粒醇溶蛋白含量见图5。从图5 中可见，与野生型相比，转基因植株中4 株籽粒的醇溶蛋白含量显著降低（P＜0.05），只有1 号植株醇溶蛋白含量未下降。可见，通过RNAi 抑制opaque2基因可有效影响高粱籽粒中醇溶蛋白的合成和积累。文献[15]在玉米上的研究表明，以opaque2（o2）基因突变体W64Ao2 为材料，运用RNAi 技术抑制Ohp（O2 heterodimerizing protein）、Pbf（Prolaminebox binding factor）的突变体和Pbf/Ohp 双基因突变体，其醇溶蛋白含量与野生型相比分别下降83%、89%和90%，opaque2、PBF 及OHP 三者间以效应物和协同作用的模式在转录水平上调控醇溶蛋白基因表达。但本实验中转基因植株中醇溶蛋白含量未与RNAi 抑制opaque2 基因程度完全吻合，其原因还需进一步研究。

图4 转基因植株opaque2 基因表达的qRT-PCR 检测结果Fig.4 Result of opaque2 gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay

图5 高粱籽粒中醇溶蛋白含量Fig.5 Kafirin content in grains

2.4.2 醇溶蛋白SDS-PAGE 电泳醇溶蛋白SDSPAGE 电泳如图6，供试野生型和各转基因植株的醇溶蛋白SDS-PAGE 电泳带型相同，约在15、20 kDa 和22 kDa 处出现3 条带，可推测通过RNAi 技术抑制opaque2 基因后，仅影响了醇溶蛋白含量，而未影响醇溶蛋白种类及存在方式。参照文献[15]对高赖氨酸高粱突变体P721 Q 进行SDS-PAGE 电泳结果可知，20 kDa 处条带为β-醇溶蛋白，22 KDa处条带为α-醇溶蛋白，但缺少分子量较大的γ-醇溶蛋白条带。参照玉米醇溶蛋白SDS-PAGE 电泳结果[15-16]推测15 KDa 处的可能为高粱的δ-醇溶蛋白。

图6 高粱籽粒中醇溶蛋白SDS-PAGE 电泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of kafirin in grains

2.5 高粱籽粒胚乳细胞透射电镜观察结果

选取转基因植株9 号和野生型高粱籽粒进行透射电镜观察，结果见图7。野生型胚乳细胞中淀粉粒排列紧密，部分大淀粉粒融合成大块状；而转基因植株淀粉粒排列疏松，细胞中存在多处孔隙（图7中1、2，4，5）。野生型胚乳细胞中蛋白质体数量较多且有一些体积较大，而转基因植株蛋白质体数量较少，体积较小（图7 中2、3、5、6）。有研究报道，玉米o2 基因突变体在灌浆过程中蛋白质体体积明显变小[16]，这与本试验结果一致。有研究表明，玉米籽粒胚乳中由于α-醇溶蛋白含量的降低，蛋白质体的数量变少且体积变小，在种核脱水过程中不能形成坚硬、致密的组织，容易导致玉米种核松软、易碎[17]。本试验中转基因植株籽粒胚乳细胞内含物排列不紧密，空隙多，也可能由于高粱籽粒在灌浆脱水过程中蛋白质体数量减少和体积变小所导致，进而使籽粒中醇溶蛋白含量降低。