半胱氨酸蛋白酶关键调控基因在针刺抗脑缺血再灌注损伤中的研究进展※

许秀洪 董苗苗 周国平 杨 路 詹珠莲 罗 梦 江沛聪

（1 南方医科大学中西医结合医院针推康复科，广东 广州 510000；2 佛山市南海区第六人民医院中医康复科，广东 佛山 528200）

脑血管病以其高发病率、高致残率及高病死率成为当前威胁人类健康的三大疾病之一，是全球第二大、全国第一大致死性疾病，其高复发率、致残率影响了患者的身体健康及家庭生活质量，同样加重了社会负担［1-2］。随着全国老年化的进展，缺血性脑梗死也逐年增长［3］。脑血管缺血后供血区会出现脑功能障碍，血液供应恢复后，其功能损伤反而更加严重［4］。目前研究较全面的缺血再灌注损伤的主要机制包括钙离子的超载、细胞的凋亡、自由基损伤以及炎症损伤等［5］。脑缺血再灌注损伤的重要表现形式是细胞凋亡，作为伴随炎症反应发生的细胞焦亡同样有重要影响［6］。这两种细胞死亡方式主要受到半胱氨酸蛋白酶（Caspase）基因家族关键调控基因—Caspase-3、Caspase-1 的调控。

Caspase 是一个半胱氨酸蛋白酶家族，目前已被发现的Caspase 共有14 种，具有部分相同的分子结构，有较高的同源性［7］。基于在级联反应中的位点及相应的作用，Caspase 家族可分为3 类：第一类是位于凋亡的始动位点，活化上游因子并激活下游的Caspase，包括Caspase-2、8、9、10 等；第二类是位于凋亡的效应位点，主要分布在级联反应中的下游，激活后的半胱氨酸蛋白酶作用于特异性底物导致细胞凋亡，包括Caspase-3、6、7 等；第三类不直接参与细胞凋亡信号的转导，主要参与白介素前体的活化并介导炎症反应，主要包括Caspase-1、4、11、13、14［8］。

1 细胞凋亡的关键基因Caspase-3 与脑缺血再灌注损伤

细胞凋亡是细胞生命活动的重要过程之一，对组织新陈代谢及免疫等方面具有重要意义和影响［9］。Caspase-3 家族是细胞凋亡通路中的枢纽位置，其中Caspase-3 是细胞凋亡中的关键蛋白酶［10］。Caspase-3 又称为CPP32（cysteine protease protein），1994 年，Fernandes-Alnemri T 等［11］发现一个新的凋亡基因编码的CPP32，相对分子质量为32 kDa。Caspase-3 在正常人的大脑神经元中表达甚少，主要以没有活性的酶原形式存在着［12］。在细胞凋亡信号诱导下Caspase-3 会被激活并发生裂解，在脑缺血的部位中蛋白表达出现升高。细胞凋亡的过程在Caspase 家族级联切割中完成。研究表明，Caspase-3 酶原被不同蛋白水解酶切割并激活［13］，进一步作用其他相关的底物，从而造成细胞发生凋亡［14］。脑缺血再灌注损伤后产生大量自由基，通过多种通路诱导激活Caspases-3，最终引发细胞凋亡。

目前认为，Caspase-3 的激活主要有3 条途径：线粒体、死亡受体和内质网途径［15］。线粒体通路：细胞受到各种凋亡信号刺激后，线粒体膜肿胀，通透性增高，释放凋亡相关活性因子细胞色素C（Cytochrome C，Cyt C），Cyt C 与凋亡蛋白酶激活因子-1（Aptosis protease-activating factor 1，Apaf l）及Caspase-9 形成凋亡小体，诱导下游Caspase 级联反应，从而完成线粒体途径的凋亡［16］。死亡受体通路：死亡信号的转导依赖死亡配体、受体死亡结构域信号转导分子的结合。其信号传导途径主要分3 条：TNFR、TRAIL 和Fas/FasL 信号途径［17］。各个途径均能在凋亡信号诱导下激活下游Caspase-3 从而引发细胞凋亡［18］。内质网途径：位于内质网中的Caspase-12 在内质网钙离子内环境紊乱以及过量内质网蛋白积累后被激活，活化后作用于Caspase-3，进而造成细胞凋亡［19］。综上表明在Caspase 家族级联反应中Caspase-3 是重要的凋亡蛋白酶，位于凋亡的枢纽地位，介导了多种凋亡途径，所以被称为“死亡蛋白酶”［20］。由于Caspase-3 在细胞凋亡中地位的重要，在实验研究当中常常将Caspase-3 作为细胞凋亡的标记［21］。脑缺血再灌注后，大鼠皮质和海马CA1 区的神经元细胞中Caspase-3 mRNA 的表达会上调，并在缺血24 h 上升最高之后逐渐下降，其变化趋势和细胞凋亡的变化趋势相同。应用Caspase-3 抑制剂后脑组织Caspase-3 蛋白酶活性及海马CA1 神经元死亡显著减少［22］。

2 细胞焦亡的关键基因Caspase-1 与脑缺血再灌注损伤

在半胱氨酸蛋白酶基因家族中，并不是所有半胱氨酸蛋白酶都参与细胞凋亡反应，还有一类为炎症相关半胱氨酸蛋白酶，包括Caspase-1、4、11、13、14 等，主要参与细胞因子介导炎症反应。Caspase-1 不参与凋亡途径，Caspase-1 基因敲除小鼠凋亡形成不受影响［23］。细胞焦亡是不同于细胞凋亡新的细胞死亡方式，依赖半胱氨酸蛋白酶-1 的介导，参与缺血再灌注损伤中的炎症发生［24］。1999 年，Miao EA 等［25］研究发现沙门杆菌感染的巨噬细胞存在Caspase-1 介导的程序死亡方式，同时伴有大量促炎因子的释放。2001 年，Cooksen 等［26］首次提出焦亡，用来描述炎性细胞的程序性死亡形式。

研究发现，不同的刺激信号可以通过不同的途径激活Caspase-1，介导细胞渗透性肿胀，胞内物质流出，细胞焦亡是通过炎性细胞因子白介素-1β 和白介素-18 使得细胞前体裂解并激活促炎症性因子的生成导致炎症反应［8］。炎性小体是一种多蛋白质复合物，作为免疫系统的重要部分，能识别病原体分子信号导致Caspase-1 的激活，使无活性的白介素-1β、白介素-18 裂解为具活性白介素-1β 和白介素-18，诱导其它炎症细胞因子的合成，诱发全身炎症反应，引发细胞的焦亡［27］。Yamasaki Y 等［28］发现短暂性脑缺血后大脑中动脉和尾壳核的腹侧和腹侧区脑内含水量、坏死和中性粒细胞浸润明显增加。研究人员向侧脑室注射重组人白细胞介素-1β（rhIL-1β）后增加了脑梗塞的面积，当注射抗白介素-1β 后脑组织含水量和脑梗塞面积均减少。李伟等［29］发现脑缺血再灌注后白介素-1β 增加可通过刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子，白细胞聚集在缺血的脑组织，从而加重脑缺血损害。Caso JR 等［30］发现大鼠大脑在缺血再灌注后，脑组织中白介素-1β 水平6 h 开始增加，24 h 表达量最高。Pradillo JM 等［31］发现大鼠脑缺血再灌注后，注射IL-1 受体拮抗剂，大鼠脑梗死的面积较缺血组减小。研究发现，大鼠脑缺血2 h 再灌注损伤24 h 后脑组织白介素-1β 阳性细胞数增加，血清白介素-1β 含量上升［32］。也有研究发现，脑缺血再灌注增加激活了Caspase-1、白介素-18 和白介素-1β 的水平［33］。已证实，在大鼠短暂性脑缺血后，皮质及海马CA1 区锥体神经元白介素-1β 在缺血3 h 表达最显著，且动态变化与脑水肿变化时间一致。应用Caspase-1 抑制剂YVAD-CMK 可显著减少脑组织白介素-1β 的含量，同时减轻脑水肿，改善缺血性脑损伤，对局灶性脑缺血再灌注后神经元损伤具有保护作用［34］。

3 Caspase-3、Caspase-1 在针刺抗脑缺血再灌注中的研究

针刺是治疗缺血性中风病的有效方法，可激活脑卒中患者的相关脑区，调节脑血流和相关分子，调节导致炎症、神经元死亡等多个分子和信号通路［35］。研究表明，针刺能通过Caspase 基因家族的调节减轻脑缺血再灌注损伤，减少脑缺血再灌注后细胞凋亡及炎症反应。

脑缺血再灌注损伤的重要方式是细胞凋亡，本课题组［36-37］通过线栓法建立MCAO 局灶性脑缺血大鼠模型，1 h 后脑缺血区已出现细胞凋亡，于24 h 达到高峰，采用电针治疗后，缺血后海马组织细胞凋亡程度较缺血再灌注组减轻。孔妍［38］采用免疫组化法和荧光PCR 检测到针刺结合康复疗法可以下调大鼠局灶性脑缺血后Caspase-3 mRNA 和蛋白的表达，并能减轻神经细胞凋亡。Xue X 等［39］研究发现电针可以改善神经功能缺损和脑梗死，可抑制缺血半暗带中的脑细胞凋亡。同时，电针可促进bcl-2 在mRNA 水平表达增加，抑制Bax 和裂解的caspase-3 阳性表达。肖姮等［40］观察针刺联合亚低温可通过减少脑梗死面积比、提高Bcl-2 表达、抑制Bax及Caspase-3 蛋白表达来降低细胞凋亡，从而达到对脑神经元细胞的保护。Li M 等［41］观察针刺联合经颅磁刺激，用免疫组织化学染色的方法检测梗死区Caspase-3 的表达，结果Caspase-3 的表达显著降低，脑梗死大鼠神经功能恢复。陈顺等［42］观察到电针干预脑缺血再灌注大鼠后Bcl-2 的表达上调，而Caspase-3 和Bax 的表达下调，推测电针可通过调控Caspase-3，减轻缺血再灌注损伤后的神经元凋亡。程莹莹等［43］观察脑缺血再灌注损伤针刺干预后大鼠的神经功能缺损症状减轻，其中Caspase-3 和PARP-1 的mRNA 及蛋白表达下调，大鼠脑缺血再灌注损伤减轻。Sun Y 等［44］给大鼠颅内注射Caspase-3 抑制剂Z-DEVD-FMK 后发现凋亡指数和梗死范围明显少于脑缺血再灌注大鼠，能有效抑制急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡，延缓脑组织细胞坏死，在一定程度上保护了脑组织功能。

脑缺血再灌注损伤后出现的炎症反应也是导致中风的重要因素。研究表明针刺对脑缺血再灌注损伤的调控作用与炎性细胞因子有关［45］。张秀婷等［46］发现针刺可减轻急性脑缺血再灌注后炎症损伤。黄伟等［47］发现针刺可以显著降低脑缺血大鼠海马区白介素-1β 的含量，减轻损伤。张亚敏等［48］发现针刺可抑制脑缺血再灌注各时期大鼠外周血清炎性细胞因子白介素-1β、白介素-6 的表达，减轻炎症损伤反应。Wan F 等［49］发现针灸通过抑制炎性细胞因子和黏附分子的产生和表达，可以有效阻断炎症反应，对脑缺血引起的神经元损伤具有保护作用。Shi P 等［50］发现脑缺血再灌注损伤大鼠经电针刺激后能够抑制过度应激，减少炎症，促进神经元的修复，促进缺血性中风的愈合。Huang J 等［51］发现电针能有效降低星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞增生中的促炎性细胞因子白介素-1β 水平，改善神经功能缺损。针刺可以减轻脑缺血再灌注后炎症反应，但关于脑缺血再灌注损伤后，Caspase-1 介导的细胞焦亡的作用研究尚少。

4 结语

针刺治疗中风的机理一直是针灸界研究的热点，我们推测，针刺能治疗中风病，可能是通过某种途径，发挥着对脑神经细胞的保护作用。为此做了大量的研究，但这些研究，尚不能完全阐明针刺治疗缺血性中风病的机理。细胞凋亡是大脑缺血再灌注后大脑受损的主要形式，细胞焦亡是近年来发现的程序性细胞死亡方式，目前在大脑的缺血性损伤中研究尚少。而且，目前研究尚未涉及对细胞凋亡和细胞焦亡及其关键调控基因Caspase-3、Caspase-1 的整体研究，对于大脑的缺血再灌注损伤后Caspase 关键基因在细胞凋亡及焦亡发展中的作用及其机制也尚未进行深入研究。因此通过研究在脑缺血再灌注损伤中Caspase-3 及Caspase-1 的作用，以期为基础及临床上治疗脑缺血疾病提供新的研究方向及理论依据。