基于代谢组学的生脉注射液治疗脓毒症作用机制研究※

柴瑞平 张晏航 路 娟 王同瑾 陈 曦*

脓毒症是一种全身炎症反应综合征，通常由微生物感染引起[1]。脓毒症患者体内的大量炎症因子，如肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素-1b（IL-1b）和白细胞介素-6（IL-6），可导致严重全身炎症反应发生，引发多器官功能障碍[2]。目前，治疗脓毒症的关键是有效快速控制炎症反应，临床常用治疗药物为糖皮质激素和抗生素。然而，这些治疗方法仅可缓解症状，并不能根治，且易出现不良反应。中医药用于治疗疾病已有2000多年历史，并且早在现代西医发明前就为中国人提供了可靠的医疗保健[3]。中医提倡组合治疗策略，不同种类中草药配方可提高疗效和减少毒性[4]。

生脉注射液由红参、麦冬、五味子三味中药组成，具有益气养阴、复脉固脱功效，适应证为气阴两亏、脉虚欲脱的心悸、气短、四肢厥冷、汗出、脉欲绝，用于治疗具有上述证候的疾病心肌梗死、心源性休克、感染性休克等。近年来一些研究证明，采用生脉注射液治疗脓毒症临床疗效显著[5-8]。但基于中医药通常通过协同作用发挥作用，反映一种整体的动态效应，因此在生脉注射液治疗脓毒症的研究中只关注一点是不合适的。选择一种与中医药整体理念一致的方法深入探讨生脉注射液治疗脓毒症的机制十分必要。

代谢组学作为系统生物学的下游领域，是基于药物治疗的全球代谢物谱来探索生物系统功能的一种集成技术。代谢组学主要着眼于整个代谢网络，而非单个代谢物，其与中医的协同作用特性高度吻合，尤其适用于中药作用机制研究。因此，代谢组学已成为评价中医药治疗复杂疾病疗效及机制的重要手段。考虑到生物样品基质的复杂性，检测仪器将是影响代谢组学分析结果的重要因素。新型轨道器高分辨率质谱分析平台具有较高的质量分辨率和质量精度、更宽的动态范围和较好的灵敏度，可以为复杂生物和中药样品的代谢组学研究提供强有力的技术支持。本研究就基于高效液相色谱-四极/轨道高分辨质谱技术的代谢组学方法探讨生脉注射液治疗脓毒症的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

TripleTOF 5600+LC/MS/MS系统（美国 AB SCIEX公司）；ML-T分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；VDUPL超纯水机（九方沃德科技有限公司）；生脉注射液（江苏苏中生物制药有限公司，批号：20170841）；水合氯醛（天津市光复精细化工研究所）。

1.2 动物

健康雄性SD大鼠24只，体重为（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。实验开始前大鼠在动物室适应性喂养7 d，随机将其分为空白组、模型组、生脉注射液组，每组8只。

1.3 模型复制、给药及代谢样本制备

采用国际公认的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症动物模型。方法如下：术前禁食 12 h，于大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）麻醉，备皮、碘仿消毒腹部，于下腹正中做一2 cm切口，暴露盲肠。于盲肠远端1/2处用无菌4号丝线结扎，用无菌中号圆针带7号丝线缝穿结扎盲肠远端，并将7号丝线双股打结，留直径约2 cm线环。采用1 ml注射器向已结扎的盲肠远端注射0.9%氯化钠注射液0.5 ml，分 2层关腹，制成脓毒症大鼠模型，观察大鼠的一般形态学变化。治疗组造模后腹腔注射生脉注射液2 ml/kg[9]，其余组予以等量0.9%氯化钠注射液干预。收集12 h夜尿，于4℃下以每分钟10 000rpm离心20 min，取尿液上清液置于EP管中，于-80℃下保存，代谢组学分析样本取原尿液，在上述条件下离心后过0.22 µm滤膜作为代谢物供试品溶液。

1.4 代谢组学分析条件

色谱柱：ACQUITY UPLCTM C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水，流动相C为10%乙腈、90%异丙醇、0.1%甲酸、10 mM甲酸铵；柱温：45℃；样品仓温度：4℃；流速：0.4 ml/min；进样体积：2 μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析。见表1。

1.5 代谢组学数据处理

表1 脓毒症大鼠尿液流动相梯度洗脱方法

代谢数据采用组学最新分析平台 ProgenisisQI 1.0 2.0（Waters公司，美国）对原始数据进行数据预处理过程，采用EZinfo 2.0（Waters公司，美国）对代谢数据进行模式识别分析，通过偏最小二乘判别分析OPLS-DA模块中的重要变量投影值VIP的大小筛选脓毒症代谢异常的小分子代谢产物作用脓毒症的尿液潜在生物标记物。最后通过国际权威代谢物组数据库HMDB收录的代谢物二级质谱图与本实验结果进行比对，鉴定生物标记物。

2 结果

2.1 形态学观察结果

空白组大鼠动作敏捷，皮毛光泽、密集，精神状态良好，二便正常。模型组大鼠活动减少、食欲明显减少、体温明显降低、体重减轻、反应迟缓、拱背耸毛、毛色无光泽、有脱毛现象，6 h后出现腹泻等症状，24 h后出现呼吸急促、动作缓慢等现象。生脉注射液组大鼠行为学表现方面与模型组比较明显改善。

2.2 代谢组学

通过聚焦影响代谢分布异常的小分子代谢产物，通过与人类代谢组数据库中收录的代谢物二级图谱比对鉴定代谢物，分别是脯氨酸、L-蛋氨酸、亮氨酸、亚精酸、牛磺酸，见表2。本部分基于TripleTOF 5600+LC/MS/MS系统的高分辨质谱检测技术对脓毒症大鼠尿液进行代谢轮廓分析，见图1。通过设定荷质比扫面范围50～1000 m/z全扫描尿液代谢数据。如图2所示，尿液代谢轮廓显示空白组和模型组大鼠的代谢分布明显分离，生脉注射液组处于两组间，且与空白组距离较近，表明采用生脉注射液治疗脓毒症大鼠临床疗效显著。如图3所示，通过对通路富集分析发现脓毒症大鼠代谢主要涉及牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。最后通过可视化软件构建代谢通路示意图（图4）。

表2 脓毒症大鼠尿液生物标志物分析

图1 空白组、模型组及生脉注射液组正负离子模式下代谢轮廓图

图2 空白组、模型组及生脉注射液组的主成分分析得分图

图3 脓毒症大鼠尿液代谢通路富集分析

图4 脓毒症大鼠模型尿液代谢通路图

3 讨论

氨基酸代谢异常在消耗性疾病中，如脓毒症中普遍存在。本研究中涉及氨基酸代谢紊乱途径主要包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。相关生理学分析发现发生脓毒症后，机体将经历高能量和高代谢状态[10]。作为能量的储存单位，氨基酸（如脯氨酸、蛋氨酸和亮氨酸）在脓毒症中将经历过度消耗，并且水平可能急剧下降。虽然氨基酸的降解在维持能量平衡中发挥着重要作用，也反映了机体的自动补偿机制，但是其可能导致氧化应激水平增加，从而恶化病情。而生脉注射液组情况有所好转，氨基酸水平升高可稳定代谢途径，同时减轻组织损伤。这种现象可能是由于生脉注射液中的葡萄糖可能被优先氧化以提供能量，使氨基酸消耗减少，血浆水平显著升高，最终氨基酸代谢开始逐渐恢复正常。

代谢通路分析发现牛磺酸与低氧代谢密切相关。牛磺酸是一种广泛存在于哺乳动物体内的游离氨基酸，在维持钙稳态、胆汁酸结合状态和膜稳定等重要生物学过程中发挥着极其重要的作用。氧化应激与炎症高度相关，在各种病理条件下同时出现并相互作用。而牛磺酸具有明显的抗氧化和抗炎作用，能明显改善脓毒症大鼠模型的炎症程度。减少牛磺酸的主要机制是细胞内流、过度消耗和缺乏合成底物。但注射生脉注射液后脓毒症大鼠的牛磺酸水平显著升高，炎症细胞因子水平显著下降。通过对生脉注射液中的成分分析发现，丹参中的丹酚酸和赤芍中的没食子酸均具有良好的抗氧化作用。在药物活性成分的协同作用下，牛磺酸能最大限度地发挥抗氧化应激作用，且在脓毒症中自耗程度较低。

精氨酸虽然不是必需氨基酸，但在严重应激情况下（如脓毒症）、或当缺乏精氨酸便不能维持氮平衡与正常生理功能，因此其称为条件性必需氨基酸。精氨酸缺乏可引起机体微循环功能障碍。研究发现，脓毒症患者组织及血液中的精氨酸水平较健康人群及非脓毒症患者低，摄入减少、内源性精氨酸生成减少以及分解代谢增加等是脓毒症患者体内精氨酸水平降低的重要原因[11]。补充外源性精氨酸能够降低脓毒症患者的感染发生率，缩短住院时间。

本研究基于经典的盲肠结扎穿孔法诱导大鼠脓毒症，对重要生物学相关代谢变化及生脉注射液的作用机制进行了初步探讨。本研究表明 TripleTOF 5600+LC/MS/MS代谢组学研究为阐明生脉注射液对脓毒症模型大鼠的能量供应、抗氧化、抗炎作用及探讨该药物对脓毒症患者的治疗机制提供了科学有力的工具。在临床上进一步加深对中药药理机制的认识，有助于进一步认识中医药理作用机制。