当归中不同部位有效化学成分分析

苏丙贺

当归为伞形科植物当归的根部，别名云归、岷归、西归等，其性温，味甘辛，具有补血活血、止痛调经及润燥通便等功效。作为补血要药，当归具有“气厚味薄，可升可降”（出自《主治秘诀》）的特点，常见于多种类型的遣药组方中，其药用价值趋向于多样化，正所谓“十方九归”。古代医家认为当归的不同部位具有不同药理学作用，整个略呈圆柱形的全当归根部分为四部分：全归、归头、归身以及归尾。明代的《本草通玄》云“头止血而上行，梢破血而下行，身养血而守中，全活血而不定”。目前从当归中分离、提取出的有效化学成分已有 160余种[1]，体现了当归药用价值的多样性。本研究从当归挥发油、阿魏酸及总鞣质三个方面，拟比较全归、归头、归身及归尾的有效成分，为中医辨证治疗使用当归不同药用部位提供可靠依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司，型号：1100）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：LA-230S）；超纯水系统（Millipore公司，型号：Milli-Q）；紫外分光光度仪（Beckman公司，型号：DU-640）；调温型电热套（广州新兴电器厂，型号：MO-2）；混匀器（江苏新康医疗器械有限公司，型号：XK-96）；电热恒温水浴锅（黄骅市渤海电器厂，型号：DZKW-4）。

1.2 实验用药

本实验所采用当归均为甘肃省岷县的道地药材，于入秋后随机采挖，洗净、去杂质后，将当归分别进行全归、归头、归身以及归尾的处理，再做成切片阴干。4种样品均由本溪市红十字会医院中药局多名药学教授鉴定，其鉴定结果符合 2010年《中华人民共和国药典》中当归性状、炮制的标准。阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：0773-9910），没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110831-200802），水为经Millipore超纯水器所得的超纯水，甲醇（色谱纯），其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的含量与成分测定

2.1.1 挥发油的含量测定参照《中华人民共和国药典》（2010年版）一部中附录XD项下乙法测定，精密称取当归各部位样品200 g，置于2000 ml烧瓶中，加水 500 ml，将挥发油测定器以及回流冷凝管与之连接，缓缓加热至液体微沸，并保持微沸状态5～8 h，停止加热后静置1 h，读取各样品中挥发油体积，并计算挥发油含量，见表1。

2.1.2 挥发油成分测定本实验应用气相色谱-质谱联用法测定挥发油，来分析当归各个药用部位中挥发油的主要成分。气相色谱条件：进样口温度为250 ℃；载气：He；分流：无；进样量：2.0 µl；程序升温：初始温度为40 ℃，2 min后以每分钟升温3℃速度至150 ℃，保留10 min后再次以每分钟升温4 ℃至220 ℃，保留8 min后继续以同样速度升温，直至250 ℃再保留1 min。质谱条件：接口温度为280 ℃；离子源温度为 230 ℃；离子化方程式为 EI+；电子能量为70 eV；扫描范围为30～500 m/z。

通过对 4组当归不同部位的挥发油成分测定发现，其主要化学成分均为藁本内酯[2]。本研究应用色谱峰面积归一化法来分析当归各个药用部位挥发油中藁本内酯相对含量，结果如图1。

图1 当归各个药用部位挥发油中藁本内酯含量比较

2.2 阿魏酸含量测定

2.2.1 色谱条件Inertsil ODS-3 C18反相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶0.5%冰醋酸=35∶65；流速：0.8 m/min；检测波长：322 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μl[3]。

2.2.2 对照品溶液制备应用电子分析天平适量精密称取阿魏酸对照品，置于20 ml棕色量瓶中，加入70%甲醇溶液，用流动相定容至刻度摇匀，配置成阿魏酸甲醇对照品溶液（0.02 g/L）。

2.2.3 供试品溶液制备将全归、归头、归身及归尾切片粉碎，分别精密称取0.2 g粉末（过三号筛）后，置于具塞锥形瓶中，再精密加入 70%甲醇溶液20 ml，密塞后称定质量，加热回流半小时，冷却后再称定质量，减失重量以70%甲醇溶液补足，摇匀，静置，取上清液用0.25 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得4组供试品溶液。

2.2.4 标准曲线绘制用电子分析天平精密量取阿魏酸对照溶液适量，用流动相配成浓度为 0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 g/L的系列对照溶液，按照2.2.1项色谱测定条件，X轴作为横坐标，表示阿魏酸的浓度，Y轴作为纵坐标，表示峰面积，绘制标准线性曲线后，回归方程：Y=496 602X+5137.2（r=0.994，P＜0.05），线性范围为 0.001～0.306 g/L，浓度范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度测试分别精密吸取上述各组供试品溶液10 µl，在上述色谱条件下，重复测定5次，根据阿魏酸峰面积来计算相对标准偏差（RSD）值，阿魏酸的平均精密度 RSD＝1.57%，表明本实验所制取的供试品溶液中，阿魏酸的精密度符合含量测定要求。

2.2.6 稳定性试验分别精密吸取10 μl各组供试品溶液，按照上述色谱条件于1 d内，连续进样6次，根据测定出的阿魏酸峰面积，计算RSD＝1.68%，表明24 h内本实验中的阿魏酸基本稳定。

2.2.7 重复性试验按照供试品溶液制备的过程和方法，将完整的全当归平行制成5份全归供试品溶液，按上述色谱条件来测定其峰面积，阿魏酸 RSD＝1.18%。

2.2.8 加样回收率试验精密称取全归样品 6份，精密加入1 ml阿魏酸对照溶液，按照供试品溶液制备过程和方法进行处理，通过上述色谱条件进行测定，阿魏酸的平均回收率为98.48%，RSD＝2.15%。

2.2.9 样品的测定分别精密吸取等量的各组供试品溶液及对照溶液，采用高效液相色谱仪测定各组阿魏酸的峰面积，计算其含量，见表1。

2.3 总鞣质含量测定

本实验测定总鞣质含量采用《中华人民共和国药典》（2010版）一部附录XB项下鞣质含量测定法。

2.3.1 对照溶液制备应用电子分析天平精密称取50 mg没食子酸置于100 ml棕色量瓶中，加超纯水稀释至刻度后，从中精密量取10 ml该溶液置于50 ml棕色量瓶中，再次加水稀释至刻度处，摇匀。

2.3.2 供试品溶液制备将实验用全归、归头、归身及归尾切片粉碎，每组样品分别精密称取0.5 g粉末（过四号筛）后，置于250 ml棕色量瓶中，加入水150 ml，12 h后超声处理10 min，待冷却后再次加水稀释至刻度，摇匀静置；沉淀后去掉50 ml初滤液，从续滤液中精密吸取20 ml置于100 ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.3.3 标准曲线绘制从对照品溶液中精密吸取0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml及 5.0 ml置于25 ml棕色量瓶中，分别加入1 ml磷钼钨酸试液后，加水至12 ml；最后加入浓度为29%的Na2CO3溶液，稀释至刻度，摇匀静置 30 min。以相应试剂为对照组，采用检测到的最大吸收波长760 nm处测定其吸光度（A），X轴作为横坐标，表示质量浓度；Y轴作为纵坐标，表示吸光度（A）。绘制标准线性曲线后，得回归方程：Y=128.50X+0.0693（r=0.978，P＜0.05），线性范围0.0031～0.15 g/L，浓度范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验精密吸取1 ml没食子酸对照溶液，按照2.2.5项流程和方法，连续6次测其吸光度（A），结果RSD=0.64%，表明仪器的精密度良好。

2.3.5 稳定性试验分别精密吸取上述各组供试品溶液10 µl，用上述方法显色，在检测最大吸收波长760 nm处重复测定其吸光度（A）6次，每次测定的间隔为10 min，结果供试品溶液的平均精密度RSD＝2.59%，表明本实验所制取的供试品溶液在显色后1 h内稳定。

2.3.6 重复性试验按照供试品溶液制备过程和方法，将完整的全当归平行的制成 5份全归供试品溶液，按上述方法测定总鞣质的含量，RSD＝2.71%，表明该方法的重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验精密称取实验用全归样品6份（0.5 g/份），精密加入适量没食子酸对照溶液，按照上述供试品溶液制备历程进行处理，平均回收率为98.63%，RSD＝2.64%。

2.3.8 样品的测定分别精密吸取2 ml各组供试品溶液及对照溶液置于为25 ml棕色量瓶中，用上述方法测定吸光率（A），计算总多酚含量；精密吸取25 ml各组供试溶液，加入适量干酪素吸附后，在应用上述方法测定吸光率（A），计算总多酚中不会被吸附的物质含量；鞣质总含量=多酚总含量减去不被干酪素吸附的物质含量，见表1。

表1 当归不同药用部位有效成分含量比较(%)

3 讨论

历代医家根据中医药传统理论和临床实践经验总结出当归的不同药用部位具有不同的功效和主治，除全当归，当归头、当归身、当归尾均可分别入药。元代的《汤液本草》有当归“头止血，身和血，梢破血”之说。在纳入研究的96 593首含当归的方剂中，收录“当归头”的方剂共30首，关于“当归身”的方剂有1011首，应用了“当归尾”的方剂有738首，而“全归/当归”的方剂有7717首[4]。药理学研究发现，当归不同部位的粉末颜色不同，其含有的有效化学成分含量亦不相同[5]。

当归中的有效化学成分以挥发油、阿魏酸、当归多糖及总鞣质等为主[6]。吴国泰等[7]研究发现，当归挥发油能抑制小鼠主动脉平滑肌收缩，起到降压作用；当归所含的阿魏酸能改善血液流变性，抑制血小板聚集[8]。本研究中归尾所含挥发油及阿魏酸含量最高，因此归尾抗血小板聚集、抑制平滑肌收缩作用可能强于其他部位。在补阳还五汤（《医林错改》）中应用当归尾，取其活血通络而不伤血之功效，与川芎、红花等同用以活血化瘀，这将传统经验用药与本研究的实验结果相联系；归身中挥发油及阿魏酸含量仅次于归尾，其西医药理作用更加温和，滋补肺肾之百合固金汤中应用归身，取其养血和血之功效，与本研究结果亦能对应；当归总鞣质能够起到收敛止血、抗氧化等作用[9]，本研究归头中总鞣质含量最高，这与《本草通玄》中“头止血而上行”相一致。

本研究中，归身和归尾中挥发油所占比例分别为0.826%和0.903%；阿魏酸在当归不同药用部位的含量为归尾＞归身＞全归＞归头，均符合《中华人民共和国药典》中规定的含量限度（不得少于0.05%）；总鞣质在归头中含量高达0.12%。以上研究结果表明，当归不同药用部位中有效化学成分含量具有一定差异。其中归身和归头中挥发油含量最高，归尾中阿魏酸含量最高，归头中总鞣质含量最高，这与其他相关研究结果相似[5]。值得注意的是，目前当归不同部位的切制得率不相同，与切制比率、切制手法相关，可能会影响当归各个药用部分中有效化学成分含量。另外，Fang等[10]运用气相色谱-质谱在不同温度下对人血浆代谢物进行加热，研究表明暴露在高温情况下，小分子代谢物会发生降解和转化。基于人体血浆代谢物与药物有效化学成分性质的不同，当归各部分在应用气相色谱-质谱联用法检测挥发油含量时，其有效成分亦可能在高温环境下发生转化或对结果造成影响。本研究下一步将探讨当归不同切制率对其不同药用部位有效化学成分含量的影响及成分提取方法的影响，以为临床应用当归提供理论依据。