膀胱癌中Galectin-3的表达及其对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响

张广云，张海芳，乔明洲

安阳市人民医院泌尿外科 河南安阳 455000

近些年来，膀胱癌的发病率呈现出上升趋势，且患者有较高的复发率和病死率[1]。膀胱癌的发生发展与癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相关。半乳凝素(Galectin)-3是Galectins家族中研究最多的一员，主要定位于细胞质，参与细胞生长、凋亡、周期调控、新生血管形成等过程[2]。多种人类肿瘤中Galectin-3呈现出过度表达，如肝癌、乳腺癌、肺癌，而其表达的抑制可抑制癌细胞的生长[3-5]。Galectin-3对膀胱癌细胞的影响目前尚未明确。本研究旨在探讨Galectin-3对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1标本来源收集2015年6月至2016年7月于安阳市人民医院接受手术切除治疗的膀胱癌患者组织标本54例，并取距肿瘤2 cm以上的癌旁正常组织作为对照组。患者中男35例，女19例，年龄46～80(62.2±11.2)岁。术前所有患者均未行放疗及化疗，样本的采集均经过患者、家属的知情同意。

1.2主要试剂和仪器NC-siRNA、Galectin-3-siRNA购自上海生工生物工程有限公司；CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京凯基公司；Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA和Ki-67单克隆抗体均购自美国Abcam公司；PCR剂盒购自日本TaKaRa公司；酶标仪购自Bio-Rad公司。

1.3细胞培养SV-HUC-1、BIU-87、T24和5637细胞在含有体积分数10%胎牛血清及青、链霉素双抗的RPMI 1640细胞培养基中，于37 ℃、体积分数5% CO2、95%饱和湿度的培养箱中常规传代培养。

1.4Westernblot检测Galectin-3、Notch1、Hes1、CleavedCaspase-3、PCNA和Ki-67的表达提取组织及细胞总蛋白。BCA法对总蛋白进行定量后用Western blot方法检测蛋白含量，其过程依次为点样、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭、一抗孵育(Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA、Ki-67和内参GAPDH，1∶1 000稀释)、洗膜、孵育HRP标记的二抗(1∶1 000稀释)、洗膜、ECL显色、显影、定影。采用Quantity One软件分析目的蛋白及内参GAPDH蛋白条带灰度值，采用Image J软件对蛋白灰度值进行量化，以目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值作为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5细胞转染接种T24细胞至6孔板，每孔2 mL，细胞生长至80%～90%融合时进行转染，细胞分为NC-siRNA组(用非特异性siRNA干预细胞)、Galectin-3-siRNA1和Galectin-3-siRNA2组(用Galectin-3-siRNA干预细胞)，未转染任何siRNA的细胞作为对照组。方法参照Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000说明。细胞转染过程中使用无血清培养基，6 h后更换为正常的细胞培养基培养。实验重复3次。

1.6Galectin-3siRNA转染T24效果评价采用qRT-PCR及Western blot两种方法。取转染48 h的各组细胞，提取细胞中的总RNA，紫外分光光度仪检测提取的RNA质量，反转录RNA为cDNA。Oligo6软件设计Galectin-3及内参GAPDH的PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Galectin-3引物序列：上游5’-GCCACTGATTGTGCCTTAT-3’，下游5’-CTCATTGAAGCGTGGGTTA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR扩增条件及程序参照PCR试剂盒。每个样品重复6次，根据所得Ct值，采用2-ΔΔCt法计算Galectin-3 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.7细胞增殖检测收集转染Galectin-3-siRNA 12、24、48 h的T24细胞，同时设对照组和NC-siRNA组，加CCK-8试剂10 μL于每孔中，常规孵育4 h，490 nm波长处采用酶标仪测定吸光度(A)值。每组设置5个复孔，计算细胞存活率。细胞存活率=(转染组细胞A值/对照组细胞A值)×100%。实验重复3次。

1.8细胞凋亡检测收集转染Galectin-3-siRNA 48 h的T24细胞，同时设对照组和NC-siRNA组，PBS洗涤及结合缓冲液重悬后，分别加Annexin-V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光室温条件下静置20 min，上机前再加400 μL结合缓冲液，1 h内采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.9统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。膀胱癌组织及癌旁正常组织Galectin-3相对表达量的比较采用配对t检验；各组间Galectin-3 siRNA转染效果，细胞存活率，凋亡率及Notch1、Hes1、PCNA、Ki-67和Cleaved Caspase-3相对表达量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1膀胱癌组织及细胞中Galectin-3蛋白的表达膀胱癌组织中Galectin-3蛋白的表达(0.389±0.042)高于癌旁正常组织(0.053±0.006)(t配对=16.937，P<0.001)。以人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1作为对照，检测膀胱癌T24、5637、BIU-87细胞中Galectin-3的表达，结果显示T24、5637、BIU-87细胞中Galectin-3的表达水平均高于SV-HUC-1细胞中的表达，T24细胞中Galectin-3的表达水平最高，选择该细胞用于后续研究。见图1、表1。

1：癌旁正常组织；2：膀胱癌组织；3：SV-HUC-1细胞；4：T24细胞；5：5637细胞；6：BIU-87细胞

图1 Galectin-3在膀胱癌组织(A)及细胞(B)中的表达

F=120.603，P<0.001；*：与SV-HUC-1细胞比较，P<0.05

2.2转染后T24细胞中Galectin-3的表达结果见图2、表2。可知，与对照组比较，NC-siRNA组Galectin-3 mRNA表达差异无统计学意义；Galectin-3-siRNA1组和Galectin-3-siRNA2组与对照组比较，Galectin-3 mRNA表达降低，Galectin-3-siRNA1组的抑制效果更明显，用于后续研究。

1：对照组；2：NC-siRNA组；3：Galectin-3-siRNA1组；4：Galectin-3-siRNA2组

图2 Galectin-3 siRNA转染后T24细胞中Galectin-3蛋白的表达

F=46.916，P<0.001；*：与对照组、NC-siRNA组比较，P<0.05

2.3抑制Galectin-3表达对细胞增殖的影响结果见表3。可知，Galectin-3-siRNA组细胞在12、24和48 h的存活率均低于对照组。

表3 各组细胞存活率的比较(n=3) %

*：与对照组、NC-siRNA组比较，P<0.05

2.4抑制Galectin-3表达对细胞凋亡的影响各组细胞凋亡率见表4。可知，Galectin-3-siRNA组细胞凋亡率高于对照组和NC-siRNA组。

表4 各组细胞凋亡率的比较 %

F=333.007，P<0.001；*：与对照组、NC-siRNA组比较，P<0.05

2.5抑制Galectin-3表达对Notch1信号及相关蛋白表达的影响结果见表5和图3。可知，Galectin-3-siRNA组Notch1、Hes1、PCNA和Ki-67表达低于对照组，Cleaved Caspase-3表达高于对照组。

表5 各组细胞Ki-67、PCNA、Cleaved Caspase-3、Notch1和Hes1蛋白表达的比较(n=3)

*：与对照组、NC-siRNA组比较，P<0.05

1：对照组；2：NC-siRNA组；3：Galectin-3-siRNA组

3 讨论

Galectin-3是目前认为与肿瘤发生密切相关的基因。Galectin-3定位于人类染色体14q21-22，可通过糖识别区域与细胞外基质蛋白、细胞表面分子、细胞内糖蛋白相互作用，从而参与细胞的增殖、凋亡及肿瘤进展等过程[6]。细胞中Galectin-3的大量表达可通过调节细胞生长而加快细胞增殖[7]。目前的研究[8]发现，Galectin-3在卵巢癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤中呈现高表达状态。本研究也检测到Galectin-3在膀胱癌组织及细胞中有高表达。

RNA干扰是由双链RNA介导的特异性同源靶基因转录后发生沉默的现象，可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，从而达到治疗的目的[9]。研究[10]显示，RNA干扰技术抑制大肠癌细胞中Galectin-3的表达后可使癌细胞增殖减慢，凋亡增加。恶性胶质瘤细胞中Galectin-3呈现高表达，转染siRNA可降低Galectin-3的表达，且Galectin-3表达的抑制可明显降低细胞的增殖，诱导细胞凋亡[11]。Ki-67位于人类基因10q25，是反映细胞增殖活性的关键指标[12]。PCNA的表达可影响细胞的增殖、生长、侵袭及DNA合成，是细胞增殖活性检测的一个有效标志物[13]。Caspase-3是Caspase家族的成员之一，其活化可诱导细胞发生凋亡[14]。目前Ki-67、PCNA、Caspase-3等的作用已在膀胱癌中得到证实[15]。有研究[16]显示，Galectin-3表达可调节癌细胞Ki-67、PCNA、Caspase-3表达，从而影响癌细胞生长。本研究结果显示，膀胱癌细胞中Galectin-3表达抑制对癌细胞增殖有抑制作用，且可诱导细胞凋亡、下调PCNA、Ki-67表达，上调Cleaved Caspase-3表达。

Notch信号由Notch受体、Notch配体、Notch调节分子、DNA结合蛋白、细胞内效应分子等组成，在许多器官及组织的正常生长发育过程中有关键作用，可通过一系列过程激活下游一些靶基因的转录，从而发挥生物学作用[17-18]。研究[19-21]表明，多种人类肿瘤中Notch信号通路处于激活状态，如膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。Galectin-3可调控Notch信号通路，影响肿瘤细胞生长[22]。本研究结果显示，膀胱癌细胞中Galectin-3表达抑制可下调Notch1及Hes1表达。

综上所述，抑制膀胱癌中Galectin-3表达可明显降低细胞活力，诱导细胞凋亡，其机制可能与Notch信号的下调有关。该研究结果提示Galectin-3可能是膀胱癌诊疗的有效靶点，但还需更多研究证实。