紫檀芪对2型糖尿病大鼠学习记忆能力及海马氧化应激水平的影响

刘欣欣，孙华磊，葛惠娜，王 腾，李文杰

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

2型糖尿病是常见疾病，临床表现为多食、多饮、多尿及体重减轻等症状，其致病机制复杂，与胰岛素抵抗有关[1]。糖尿病认知功能障碍，通常指糖尿病本身代谢紊乱及微血管病变所致的大脑功能异常，常无明确的脑血管疾病临床表现，近似阿尔茨海默病，多为轻度认知功能障碍[2]。近年来，2型糖尿病发病率呈明显上升趋势，由其引发的认知功能障碍也日益引起研究者[3]的高度重视。因此，深入探讨2型糖尿病认知功能障碍的防治方法，具有重要的临床价值。紫檀芪是一种广泛存在于天然植物中的二苯乙烯类化合物，具有多种生物学活性，如抗氧化、抗炎、调节血糖等[4-7]。研究[8-9]发现，在糖尿病啮齿类动物中，紫檀芪具有改善糖代谢异常的作用。有研究[9]结果显示，连续口服紫檀芪6周后血糖水平降低56.54%，血胰岛素水平升高；同时，紫檀芪还可降低糖化血红蛋白含量，减弱糖异生酶葡萄糖-6-磷酸酶和果糖-1,6-二磷酸酶的表达，增加糖酵解酶己糖激酶的表达。此外，在脂肪细胞中，紫檀芪可以抑制细胞增殖、脂质积聚和三酰甘油的蓄积[10]；它通过下调瘦素、抵抗素和脂肪酸合成酶以及上调脂联素的表达，来发挥抑制脂质生成的作用。本研究旨在探讨紫檀芪对2型糖尿病的改善作用及其机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂卓越360全自动生化分析仪(上海科华生物工程股份有限公司)、Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司)、SMG-2水迷宫程序自动控制仪(中国医学科学院药物研究所)、罗氏血糖仪(罗氏诊断产品上海有限公司)、链脲佐菌素(美国Sigma公司)、紫檀芪(上海士丰生物有限公司)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒和丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、葡萄糖测定试剂盒和胰岛素测定试剂盒(中生北控生物科技有限公司)。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立及实验分组选取4周龄SPF级健康雄性SD大鼠100只，体重170～220 g，由河南省实验动物中心提供，饲养于郑州大学公共卫生学院实验动物中心。室温为18～23 ℃，相对湿度为45%～55%，通风良好，动物分笼饲养，自由饮水、摄食，昼夜间隔12 h。

普通饲料由河南省实验动物中心提供；高脂高糖饲料：含质量分数59.5%普通粉状饲料、质量分数20.0%蔗糖、质量分数10.0%猪油、质量分数10.0%蛋黄粉、质量分数0.5%胆酸钠。

100只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法选取10只作为正常对照组，给予普通饲料喂养，其余大鼠给予高脂高糖饲料喂养。4周后夜间禁食12 h，按40 mg/kg剂量一次性空腹注射链脲佐菌素溶液，制备2型糖尿病大鼠模型。正常对照组大鼠腹腔注射相等体积的枸橼酸钠缓冲液。注射链脲佐菌素72 h后，尾静脉采血检测大鼠空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L并且出现多饮、多食、多尿症状即为造模成功[11-12]。按上述成模标准筛选出75只大鼠，造模成功率为83.3%。选取造模成功的大鼠40只分为2型糖尿病组、紫檀芪低剂量(20 mg/kg)组、紫檀芪中剂量(40 mg/kg)组、紫檀芪高剂量(80 mg/kg)组，每组10只。紫檀芪干预组于每日固定时间按照体重计算灌胃剂量并灌胃1次。正常对照组和2型糖尿病组于每日固定时间给予羧甲基纤维素钠溶液灌胃1次。连续干预7周后，各组大鼠进行Morris水迷宫实验，然后腹腔主动脉取血测定血糖和血清胰岛素。

1.3大鼠学习记忆能力的检测干预7周后，各组大鼠进行Morris水迷宫实验[13]，测定各组的逃避潜伏期和穿越平台次数，进而判断大鼠的学习记忆能力。水迷宫为直径130 cm、高80 cm的圆形黑色水池，其水深为60 cm，水温为(22±2) ℃。此水池包括东、西、南、北4个象限，在第3个象限正中水下2 cm处设置直径为15 cm的圆形平台。将大鼠从东、西、南、北4个象限池的中点放入水中开始计时，以大鼠找到平台2 s终止记录，此时间为逃避潜伏期。每只大鼠每天训练4次，连续训练5 d，记录最后一次逃避潜伏期的训练结果。最后一次训练结束后的第2天撤除平台，任选一个入水点(所有受试大鼠入水点保持一致)将大鼠面向池壁放入水中，记录60 s内大鼠穿越平台次数。

1.4血糖和血清胰岛素的测定水迷宫实验结束后，各组大鼠夜间禁食、不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛，仰卧位于固定板上，备皮消毒后，打开腹腔，使用真空负压管于腹主动脉处采取15 mL血液，置于冰上静置30 min，然后4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清。采用全自动生化分析仪检测血糖和血清胰岛素，检测方法参照试剂盒说明，空腹血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，血清胰岛素检测采用胶乳免疫比浊法。

1.5大鼠海马组织氧化应激水平的测定血样采集完毕，断头处死大鼠，在冰上剥离脑组织，快速分离海马。加入PBS中研磨成体积分数10%的海马组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，采用Bradford法测定蛋白含量，以黄嘌呤氧化酶法检测SOD 活性，硫代巴比妥酸染色法检测MDA，操作步骤参照试剂盒说明。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学分析。4组大鼠各检测指标的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1紫檀芪对各组大鼠血糖、血清胰岛素水平的影响结果见表1。由表1可知，与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量组和中剂量组的血糖降低；同时，2型糖尿病组的血清胰岛素水平高于正常对照组，紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组的血清胰岛素水平均低于2型糖尿病组。

表1 各组大鼠血糖、血清胰岛素水平比较

*:与正常对照组相比，P<0.05；#：与2型糖尿病组相比，P<0.05

2.2紫檀芪对各组大鼠学习记忆能力的影响结果见表2。由表2可知，在Morris水迷宫实验中，2型糖尿病组大鼠的逃避潜伏期长于正常对照组，穿越平台次数少于正常对照组；紫檀芪干预7周后，与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠的逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加；紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组的逃避潜伏期和穿越平台次数比较，差异无统计学意义。

2.3紫檀芪对各组大鼠海马组织SOD活性和MDA水平的影响结果见表3。由表3可知，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠海马组织的SOD活性降低，MDA水平增高；与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠海马组织SOD活性升高，MDA水平降低；紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组SOD活性、MDA水平比较，差异无统计学意义。

表2 各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较

*:与正常对照组相比，P<0.05；#：与2型糖尿病组相比，P<0.05

表3 各组大鼠海马组织氧化应激水平的比较

*:与正常对照组相比，P<0.05；#：与2型糖尿病组相比，P<0.05

3 讨论

研究[14-15]显示，2型糖尿病可以影响患者的认知功能，2型糖尿病患者发生轻度认知功能障碍的风险较非2型糖尿病患者增加1.5倍。目前，对2型糖尿病认知障碍的发病机制及原因尚不完全清楚，同时缺乏有效的防治手段，对2型糖尿病认知功能障碍的探索和防治日益成为备受关注的问题。

糖尿病所引起的认知缺陷主要表现为语言语义记忆、情景记忆、空间记忆能力等受损。本研究中Morris水迷宫实验结果显示，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠的潜伏逃避期延长，穿越平台次数减少；而紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组的逃避潜伏期较2型糖尿病组大鼠缩短，穿越平台次数较2型糖尿病组大鼠增加。结果说明紫檀芪对2型糖尿病大鼠的学习记忆能力具有改善作用。有研究[16]结果显示，紫檀芪可以通过激活Caspase途径保护神经细胞。然而紫檀芪如何改善2型糖尿病大鼠的学习记忆能力还需进一步探索。

氧化应激与2型糖尿病认知功能障碍的发生发展密切相关[17]。SOD和MDA是反映氧化应激水平的重要指标。SOD在机体氧化和抗氧化的平衡中发挥重要作用，它反映清除氧自由基的能力[18]。MDA为机体脂质过氧化产物，间接反映细胞损伤程度[18]。本研究中，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠海马组织的SOD活性降低，MDA水平升高。与2型糖尿病组大鼠相比，3个紫檀芪干预组大鼠海马组织的SOD活性升高，MDA水平降低。结果提示紫檀芪可能通过发挥抗氧化作用减少海马组织的过氧化物的产生，提高SOD活性，改善2型糖尿病大鼠的学习记忆能力。

目前，对于2型糖尿病认知功能障碍的发病机制尚未有统一认识，对其治疗主要是药物干预。本研究结果显示，紫檀芪具有改善2型糖尿病大鼠学习记忆能力的作用，为预防和治疗2型糖尿病认知功能障碍提供了一种新思路。