棉花不同部位内生真菌群落结构及多样性分析

宋海燕，李丽莉，李超，秦华伟，宋莹莹，卢增斌，于毅，门兴元*

（1.山东省农业科学院植物保护研究所，济南250100；2.南京农业大学，南京210000）

植物内生真菌一般是指全部或部分生活周期内生活在植物体内，但对宿主植物组织不引起明显病害症状的1类真菌[1-2]。内生真菌是巨大的资源宝库，其次生代谢产物十分丰富，甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，是天然产物的重要来源[3-5]。宿主植物与内生真菌是互利互惠的共生关系，在长期进化过程中形成了协同进化机制，真菌的特定代谢产物能刺激宿主生长发育，提高其对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力[6-7]。例如，内生真菌Cladorrhinum foecundissimumS8的接种可使棉花根腐病的发病率降低45.5%～70.0%[8]；多黏芽胞杆菌Paenibacillus poly-myxa、解木聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus xylanilyticus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis联合处理的棉株，在开花期未发生黄萎病，并且3种菌联合灌根处理效果优于单菌株施用效果[9]。因此，植物内生真菌已成为筛选新化合物和新药的重要资源库[10-12]。

棉花，锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium）植物，是世界上最主要的农作物之一，是我国重要的经济作物和纺织原料来源[13]。大量的研究表明，棉花终生带有内生菌群[14-16]。目前对棉花内生真菌的研究涉及内生真菌分离、种属鉴定、多样性分析等方面，但缺乏系统性的研究。本文对内生真菌在棉花叶、茎、铃的群落结构和多样性进行分析，明确不同部位内生真菌的分布，旨在为棉花内生菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年在棉花花铃期（7月13―22日），每个采样地（表1）设置1个采样点，采集新鲜健康的10株棉花样本，将其立即放入密封袋中，贴上标签，低温保存带回实验室，在4℃下保存。

表1 采样地情况简介

采用马铃薯葡萄糖（Potato dextrose agar，PDA）培养基分离内生真菌。其中，新鲜马铃薯200 g，洗净去皮后切成小块，沸水煮30 min，用纱布过滤取滤液，加入琼脂3.5 g，葡萄糖200 g，定容2 000 mL。121℃灭菌30 min。待培养基冷却至45℃时，加入质量浓度为100 mg·L－1的硫酸链霉素1 mL防止细菌污染。

1.2 主要试剂和仪器

SW-CJ-2FD洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产；RXZ型智能人工气候培养箱，宁波江南仪器厂生产；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂生产；DYY-6D型电泳仪，北京六一仪器厂生产；5424小型台式高速冷冻离心机，Eppendorf公司生产；SW-TFG-15型通风柜，杭州得聚仪器设备有限公司生产；HHC型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限责任公司生产；749540-0000型微量电动组织匀浆器，美国KIMBLE CHASE公司生产；2720热循环仪，美国Applied Biosystems公司生产；Gel-Doc-itTS3凝胶成像分析系统，美国UVP公司生产；引物ITS1、ITS4、真菌DNA提取试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1样本表面消毒。选取无病害症状、新鲜健康的棉叶、棉茎、棉铃用无菌水冲洗，去除表面的泥土和灰尘，用灭过菌的滤纸吸干表面的水分，室温晾干。将棉叶剪成边长2 cm的正方形叶片，棉茎剪成长约2 cm的小段，棉铃切成1/2，均用75%（体积分数）的乙醇浸泡30 s，然后用2%（质量分数）次氯酸钠浸泡3 min，用无菌水漂洗5次。最后，用灭菌的镊子将棉叶、棉茎、棉铃放置于灭菌滤纸上。

1.3.2内生菌的分离、保存。将刀片在酒精灯火焰上灼烧灭菌，待冷却后，将棉叶、棉茎边缘去除，叶片剩余部分切成2个边长约0.5 cm的正方形小块，茎切成2个长约0.5 cm的小段。将各样本放入装好培养基的培养皿中，并做好标记，置于培养箱中培养3～4 d。记录被内生真菌侵染的样本数。

待平板上菌落长出，根据其形态特征判断分离菌落种类，用取尖端菌丝或者平板划线等方法分离纯化，经反复分离、纯化，直至得到纯化的菌落。将纯化的菌株分别转移至斜面培养基上，菌株生长旺盛时，取出至4℃下保存。

1.3.3内生真菌的ITS鉴定。内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）鉴定是指对序列进行扩增，将扩增产物测序，通过将测序得到的序列与已知真菌序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。本研究采用Ezup柱式真菌DNA提取试剂盒提取内生真菌总DNA，使用真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）扩增内生真菌rDNA-ITS序列[12]。ITS扩增的聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction，PCR）反应体系（25μL）：ddH2O 17.25μL，Buffer l 2.5μL，dNTPs 2μL，F引物 （ITS1）1μL，R引物（ITS4）1μL，HiFi酶0.25μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件：93℃预变性3 min，93℃变性45 s，57℃复性45 s，72℃延伸90 s，35个循环。扩增产物回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将ITS序列的测序结果用美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Blast软件与GenBank数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，获得分子鉴定结果。

1.4 数据处理

采用定植率（Colonization rate，CR）评估棉茎、棉铃被内生真菌侵染的程度；采用相对分离率（Relative frequency，RF）比较判断优势菌属；采用Shannon-Weaver指数（H）分析内生真菌的群落生物多样性；用Evenness（E）均匀度指数分析群落物种分布的均匀度；用Margalet丰富度指数（R）分析群落物种的丰富程度；用Jaccard相似性系数（Jaccard’s similarity coefficient，SJ）分析2个地区内生真菌种类组成的相似程度。计算公式：CR＝（S/N）×100%，其中S指受内生真菌侵染的样本数，N指总样本数；RF＝（Ni/N）×100%，其中Ni为某种内生真菌的菌株数，N指总菌株数其中k指某宿主中内生真菌的种类，Pi指某种内生真菌的相对分离率；E＝H/lnS，其 中H为Shannon-Weaver指数，S为物种总数；R＝（S－1）/lnN，其中S为样方内物种数，N为样方内所有物种的个体总数；SJ＝j/（a＋b－j)，其中j指2个地区共有的内生真菌菌属数，a、b指2个地区各自分离到的内生真菌的菌属数。当SJ为[0.00，0.25)时，为极不相似；SJ为[0.25，0.50)时，为中等不相似；SJ为[0.50，0.75)时，为中等程度相似；SJ为[0.75，1.00]时，为极为相似。

采用Microsoft Excel 2007进行数据计算和曲线绘制。

2 结果与分析

2.1 棉花不同部位内生真菌定植率

图1 棉花不同部位内生真菌的定植率

由图1可知，4个地区都是棉叶的内生真菌定植率最高。其中：茌平的棉叶内生真菌定植率最高，为70.00%；曹县和郓城棉茎内生真菌定植率最低，仅为5.00%。不同地区同一部位的内生真菌定植率比较，茌平的棉叶和棉茎最高，郓城的棉铃定植率最高。

2.2 棉花不同部位内生真菌组成

在4个地区40株棉花的叶、茎、铃共240个样本中共分离出79个菌株，归属于16个属，分别为链格孢属Alternaria、镰刀菌属Fusarium、分子孢子菌属Cladosporium、黑孢子菌属Nigrospora、青霉属Penicillium、旋孢腔菌属Cochliobolus、暗球腔菌属Phaeosphaeria、毛球腔菌属Setosphaeria、中国炭疽菌属Colletotrichum、茎点霉属Phoma、弯孢属Curvularia、间座壳属Diaporthe、离蠕孢属Bipolaris、附球菌属Epicoccum、Gibellulopsis、白僵菌属Beauveria，其中链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、黑孢子菌属在棉花叶、茎、铃中均出现（表2）。

表2 不同部位内生真菌的群落组成（菌株数分类统计）

济阳棉花共分离出22个菌株，其中棉叶分离出8个菌株，棉茎分离出7个菌株，棉铃分离出7个菌株，归属于9个属，分别为链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、青霉属、旋孢腔菌属、黑孢子菌属、暗球腔菌属、毛球腔菌属、中国炭疽菌属；茌平棉花共分离出31个菌株，其中棉叶分离出14个菌株，棉茎分离出9个菌株，棉铃分离出8个菌株，归属于9个属，分别为链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、茎点霉属、弯孢属、间座壳属、黑孢子菌属、离蠕孢属、附球菌属；曹县分离出6个菌株，其中棉叶分离出3个菌株，棉茎分离出1个菌株，棉铃分离出2个菌株，归属于2个属，为链格孢属、Gibellu-lopsis；郓城共分离出20个菌株，其中棉叶分离出10个菌株，棉茎分离出1个菌株，棉铃分离出9个菌株，归属于5个属，分别为链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、黑孢子菌属、白僵菌属。

2.3 棉花不同部位内生真菌的相对分离率

由表3可知，济阳棉叶的优势属为链格孢属和毛球腔菌属，相对分离率均为37.50%，棉茎的优势属为镰刀菌属，相对分离率为28.55%，棉铃的优势属为中国炭疽菌属，相对分离率为100.00%；茌平棉叶、棉茎、棉铃的优势属均为链格孢属，相对分离率分别为57.14%、33.34%、100.00%；曹县棉叶、棉茎、棉铃的优势属均为链格孢属，相对分离率分别为66.67%、100.00%、100.00%；郓城棉叶、棉茎的优势属为链格孢属，相对分离率分别为80.00%、100.00%，棉铃的优势属为黑孢子菌属，相对分离率为44.44%。

表3 棉花不同部位内生真菌相对分离率%

2.4 棉花不同部位内生真菌多样性

由表4可知，各 地区叶、茎、铃 的Shannon-Weaver指数（H）、Evenness均匀度指数（E）、Margalet丰富度指数（R）高低顺序不一致。济阳棉花不同部位H、E、R的大小顺序均为茎＞叶＞铃；茌平棉花不同部位H、E的大小顺序为叶＞茎＞铃，而R的大小顺序为茎＞叶＞铃；曹县棉花不同部位的H、E、R大小顺序为：叶＞茎＝铃；郓城棉花不同部位的H、E、R大小顺序均为铃＞叶＞茎。

表4 棉花不同部位内生真菌多样性

2.5 棉花不同部位内生真菌相似性

由表5中Jaccard相似性系数（SJ）可知：对于同一地区棉花不同部位的内生真菌，曹县的叶与茎、铃中等程度相似，茎与铃极为相似，郓城的叶与铃中等程度相似，其余地区的各部位都不相似；对于不同地区棉花同一部位的内生真菌，茌平的叶与郓城的叶中等程度相似，茌平的铃与曹县的铃、曹县的茎与郓城的茎极为相似，其余地区的同一部位不相似；对于不同地区棉花不同部位的内生真菌组成，济阳的茎与郓城的叶和铃中等程度相似，茌平的铃与曹县的叶中等程度相似，与曹县的茎、郓城的茎极为相似，曹县的叶与郓城的茎中等程度相似，曹县的铃与郓城的茎极为相似。

表5 棉花不同部位内生真菌Jaccard相似性系数（SJ）

3 结论与讨论

通过对4个地区棉花的取样调查，发现内生真菌在棉花的不同部位中普遍存在。其中，棉叶的内生真菌定植率最高，棉铃、棉茎定植率因地区不同大小各有差异。吴晓菡等研究山胡椒不同部位内生真菌的组成发现，茎中内生真菌定植率最高，叶中最低[5]，与本研究结果不一致。这可能与宿主植物不同有关。本研究4个地区共分离出79个菌株，归属于16个属，分别为链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、青霉属、旋孢腔菌属、黑孢子菌属、暗球腔菌属、毛球腔菌属、中国炭疽菌属、茎点霉属、弯孢属、间座壳属、离蠕孢属、附球菌属、Gibellulopsis、白僵菌属。其中，链格孢属在4个地区均出现，镰刀菌属、分子孢子菌属、黑孢子菌属在3个地区均出现，表明这些内生真菌没有区域专一性，其余内生真菌均表现出区域专一性。链格孢属、镰刀菌属、分子孢子菌属、黑孢子菌属等4个菌属在棉花叶、茎、铃3个部位中均出现，表明这4个菌属没有组织专一性。有的内生真菌表现出不同的器官或组织偏好性，暗球腔菌属、毛球腔菌属、离蠕孢属、附球菌属、Gibellulopsis只在棉叶出现；茎点霉属、间座壳属、青霉属、旋孢腔菌属只在棉茎中出现；中国炭疽菌属、白僵菌属只在棉铃出现。链格孢属和镰刀菌属是常见的真菌，可侵染多种植物，从而造成巨大的经济损失，有些可侵染人和动物，造成严重的疾病；但也可作为被利用的真菌资源，具有杀虫、杀菌等作用，有利于动植物的生长发育[17-24]。

同一地区棉花的不同部位中内生真菌种类和数量具有较大的差异，不同地区的棉花同一部位中内生真菌种类和数量也不相同。这与吴晓菡等[5]对山胡椒、刘建青[25]对小麦、游见明[26]对茶树不同部位的研究结果一致。4个地区棉叶的内生真菌优势属均为链格孢属，而不同地区棉花茎、铃的内生真菌优势属不同：济阳棉茎的为镰刀菌属，茌平、曹县、郓城棉茎的均为链格孢属；济阳棉铃的为中国炭疽菌属，茌平棉铃的为链格孢属，曹县棉铃的为链格孢属，郓城棉铃的为黑孢子菌属。

从内生真菌的Shannon-Weaver指数（H）、Evenness均匀度指数（E）、Margalet丰富度指数（R）看，4个地区棉叶表现出丰富的生物多样性，济阳、茌平的棉茎表现出丰富的生物多样性，郓城的棉铃表现出丰富的生物多样性。这可能与采样地点和植株结构有关。

笔者等曾对不同地区棉花叶片内生真菌做过研究，表明地域对内生真菌群落组成具有很高的影响[27]。本文对棉花不同部位的研究结果表明，植物器官对内生真菌的分布也具有较大的影响，这可能与各器官的结构、形态特征有关。其他影响因子，例如植物种类、生长阶段等对内生菌分布的影响，还需进一步更全面的研究。