人眼表细菌菌群分布及影响因素分析

杨美娜 闵寒毅

健康的眼表对于正常视功能的维持至关重要。在结构上，眼表与眼睑皮肤相延续，由结膜，角膜，巩膜和泪膜组成，通过与其他成分（如免疫细胞、激素、小分子物质及微生物群落等）相互作用，形成眼表微环境。正常的眼表微环境对于眼表健康是关键的。大多数人的眼表存在着相对稳定的微生物群落[1]。眼表微生物群落包括真菌、细菌及病毒等微生物种类，但数量最多且最重要的是细菌[2]。菌群受自身营养代谢和宿主免疫屏障等因素作用，形成稳定的共生状态，正常情况下并不致病，即结膜囊的正常菌群。机体免疫力下降时，部分定植细菌异常增殖，引起眼部感染，称之为条件致病菌。

1 眼表细菌菌群的取样、培养、鉴定方法

1.1 取样

目前大多数研究采用的方法是以拭子于结膜囊取样。该类方法阳性率高，而又以湿棉拭子取样培养阳性率最高。其他眼表标本取样方式包括泪液拭子、结膜印迹试纸、睑缘拭子、脱落睫毛等[3]。

1.2 培养及鉴定

传统的细菌培养和鉴定方法依赖于实验室培养和细菌的形态学特征。其结果受培养相关因素影响，包括采样方法、培养基类型（包括“血琼脂”和“巧克力琼脂”）、大气条件（需氧，微需氧和厌氧）、温度、湿度和培养时间[4]。而新型鉴定方法，如16S rRNA 测序，不受理化因素的限制，检出率更高。其他方法还包括宏观基因组测序（更常用于分析微生物代谢和功能途径）、计算机模拟核型分析、PCR、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和焦磷酸测序。

传统的细菌培养鉴定受各种理化因素影响较大，且依赖于细菌的形态生物学，检出阳性率较低，而以16S rDNA/16S rRNA 高通量测序为代表的分子生物学鉴定方法，具有高灵敏度和特异性，能够全面、精确地鉴定眼表细菌菌群的种属组成。

16S rDNA 存在于细菌染色体基因组，具有保守性、普遍存在性及特征性，被作为微生物检测和分类鉴定的一种强有力的分子指标。因16S rDNA 检测为非培养性分析技术，故结果不受抗生素使用的干扰，并适用于鉴定死菌和尚无法培养的细菌。但16S rRNA 高通量测序对设备条件和实验成本较传统的表型鉴定高，故成本是目前限制其推广的关键因素。

2 眼表细菌菌群的分布情况

回顾国内大样本研究，国内基于传统培养及分离鉴定方法的报道基本一致：正常结膜囊菌群主要包括凝同酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌和链球菌，其中表皮葡萄球菌是最常见的眼表菌株。孙旭光等[5]对1 411 份结膜囊标本进行培养，阳性率为35.9%。由高至低分别为凝固酶阴性葡萄球菌（表皮葡萄球菌为主，36.2%）、棒状杆菌（16.8%）、微球菌属（12.5%）、金黄色葡萄球菌（10.7%）。王娟等[6]对25 728 名受试者进行结膜囊细菌培养,检出率最高的3 种细菌分别为表皮葡萄球菌（71.47%)、链球菌属细菌（11.78%)和金黄色葡萄球菌（7.43%)。对1992—2004 年国内正常人结膜囊细菌培养进行Meta 分析显示阳性率最高的依次为表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、微球菌及类白喉杆菌[7]。国外文献报道和国内的研究结果基本一致，健康眼表最常见的细菌是凝固酶阴性金黄色葡萄球菌（包括表皮葡萄球菌），其次为丙酸杆菌属、棒状杆菌属、金黄色葡萄球菌属、链球菌属和微球菌属[2]。基于16S rDNA 基因高通量测序得到健康人眼表细菌种属的结果与传统的一致[8-9]。有学者提出眼表核心菌群的概念，认为假单胞菌（20%），丙酸杆菌（20%），根瘤菌（16%），棒状杆菌（15%），不动杆菌（12%），短波单胞菌（5%），葡萄球菌（4%），水杆菌（2%），鞘氨醇单胞菌（1%）和链球菌（1%）等常见的12 个属眼部微生物群为眼表核心微生物群[2]。

3 眼表细菌菌群的影响因素

3.1 年龄及性别

国内外的研究均支持年龄影响结膜囊带菌状况，其中10 岁以下及60 岁以上者结膜囊细菌阳性率较高[6，10]。老年组阳性率高，可能与免疫功能减退，泪膜稳定性差，泪液分泌减少、泪液成分（抗体、补体、乳铁蛋白、溶菌酶等）缺乏致眼表的防御性功能降低有关[11]。1 岁以上儿童最常见为表皮葡萄球菌[12]，可能与过敏性结膜炎、倒睫等刺激导致的不良生活习惯（比如喜揉眼）有关。新生儿结膜囊分泌物培养阳性率差异较大，菌株多样，可能受新生儿免疫功能低下及分娩方式影响。

尽管已有证据证明结膜囊细菌受性别影响[13-14]，但尚无定论。国内有报道称男性结膜囊细菌阳性率普遍高于女性[6，15]，而国外的文献报道更倾向于两者之间没有明显差异[10，16]。

3.2 季节

季节主要表现为温度及湿度的改变，而两者为影响微生物群落演进的重要因素。结膜囊温度和湿度相对稳定，但受环境温度与湿度影响[17]，并可能影响结膜囊菌群。国外学者从人口水平，分别以“腋臭、脚气及胃肠胀气”三个明确与微生物群落有关的症状及疾病为关键词，统计网络上相关关键词的频率变化，显示该类其检索频次呈季节性变化，间接说明季节对人体微生物群落的影响[18]。国内学者证明结膜囊带菌情况随季节变化[19-20]，春季（70.5%）及夏季（67.7%）结膜囊细菌培养阳性率较高，而秋季（42.8%）与冬季（40.4%）较低，差别显著，但各季节培养的细菌种类均以凝固酶阴性的葡萄球菌为主，多为表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌（占60.19%）[20]。

3.3 生活习惯

生活习惯对眼表菌群的影响的热点主要集中于角膜接触镜的使用。目前的研究更倾向于佩戴角膜接触镜导致眼表菌群的改变，并认为其与眼表感染相关。Sankaridurg 等[21]发现佩戴软性角膜接触镜与病原菌的定植，尤其是革兰氏阴性菌如粘质沙雷氏菌和流感嗜血杆菌显著相关。与非镜片佩戴组相比，佩戴组的干燥结膜拭子检测结果差异更大，接近于皮肤细菌群落结构；其甲基杆菌、乳酸杆菌、不动杆菌和假单胞菌丰度更高，而嗜血杆菌、链球菌、葡萄球菌和棒状杆菌丰度更低[22]。连续一年佩戴软性角膜接触镜者结膜囊菌群丰度较对照组高[23]，而检出的菌群类型无明显差异。

3.4 是否伴发其他疾病

3.4.1 干眼症 泪液在眼表分布形成泪膜，起润滑作用，同时含有抗菌物质，如溶菌酶、乳铁蛋白、免疫球蛋白A（IgA）、载脂蛋白和补体等，具有免疫防御作用。干眼症患者的泪液因质和量的改变，导致局部的防御机制减退，因此影响泪膜稳定性的因素可能导致眼表菌群改变。Graham 等[8]比较正常和干眼患者眼表菌群，发现正常组常规细菌培养的阳性率为75%，干眼组为97%，凝固酶阴性葡萄球菌（表皮葡萄球菌为主）是最常分离的细菌；而16S rDNA 测序提示干眼组细菌总体水平较正常组高，但主要菌群一致。而在与干眼症密切相关的MGD 组（meibomian gland dysfunction）发现结膜囊细菌的阳性率及种类均较正常组高，且与干眼严重程度呈正相关，分离出的主要菌株均为葡萄球菌，棒状杆菌和微杆菌科[24]。

3.4.2 睑缘炎 高瑞等[25]对101 例睑缘炎患者与85 例健康者做细菌培养阳性的菌株鉴定发现，睑缘炎组眼表带菌量高于健康者，但葡萄球菌属的阳性率低于正常对照组。朱越峰等[26]报道与健康者相比，睑缘炎组结膜囊细菌培养阳性率较高，以表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及棒状杆菌为主。Lee 等[27]对睑缘炎患者和健康者的眼表样本进行DNA 测序分析，发现睑缘炎组眼表含有更多的链霉菌、棒状杆菌和栖水菌，而葡萄球菌，链霉菌，棒状杆菌，栖水菌和丙酸杆菌均较正常减少。

3.4.3 白内障 国内外研究表明[28]，白内障患者结膜囊带菌率均高于健康者，主要菌株为表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。程莹莹等[29]对2004 年1 月—2013 年9 月发表的国内白内障术前结膜囊细菌培养的文献进行Meta 分析发现白内障术前结膜囊培养阳性率为26.03%，以表皮葡萄球菌（67.30%）、金黄色葡萄球菌（12.53%）和微球菌（6.98%）为主。但白内障患者多为老年人，需排除年龄因素的影响。

3.4.4 糖尿病 国外一项较大规模回顾性研究显示[30]，糖尿病患者结膜囊检出率最高者为金黄色葡萄球菌和克雷伯氏菌，且肠球菌和α-溶血链球菌的检出率增加。国内文献报道糖尿病组和对照组结膜囊细菌主要为革兰氏阳性菌，其中表皮葡萄球菌和丙酸痤疮杆菌检出率最高[31]。有文献报道糖尿病患者结膜囊细菌检出率及种类与对照组无明显差异，与糖尿病病程以及类型无直接的关系[32-33]。但有学者提出[34]，糖尿病患者中各菌门的检出率与对照组无明显差异，但在糖尿病组中变形菌更为丰富，其不动杆菌含量更高。因此糖尿病患者眼表菌群特征尚待进一步研究。

4 结论

传统的培养鉴定方法容易受各种理化因素影响，细菌检测阳性率低、稳定性差。新一代测序和生物信息学方法（如16SrRNA测序）鉴定的眼表微生物群阳性率高。国内外不同研究者研究结果进行比较，健康人眼表细菌培养阳性率、细菌种属、分布存在有差异，但前三位始终是凝固酶阴性的表皮葡萄球菌、棒状杆菌、金黄色葡萄球菌。在干眼症患者和睑缘炎患者中，结膜囊细菌的阳性检出率均较正常高，前者葡萄球菌呈增多趋势，而后者呈减少趋势。角膜接触镜的佩戴，可能导致眼表微生物菌群的改变，增加眼表感染的机会。眼表微生物组的持续研究对于我们了解眼表微环境的稳态，以及其在眼科疾病中的作用十分必要，为我们预防和治疗眼病提供了新思路。