难治性癫痫患儿脑组织srGAP2 γ-氨基丁酸及MCP-1表达的意义

刘 伟 吕秀丽 李战华△

1)驻马店市第一人民医院儿科，河南 驻马店 463000 2)驻马店市中心医院新生儿重症监护室，河南 驻马店 463000

癫痫系无中枢神经占位性疾病或系统进行性疾病，其发作与多种病因密切相关[1-4]。小儿难治性癫痫患者一般每月至少发作4次以上[5-8]，治疗后临床病情反复，经2 a以上正规抗癫痫治疗后患者病情依旧无法达到有效控制[9-14]。小儿难治性癫痫预防和治疗是临床亟待解决的难题，是神经病学研究的难点和热点。难治性癫痫占癫痫的20%～30%。研究[4-6，15-18]显示，srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1与小儿难治性癫痫存在一定联系。本研究探讨srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在难治性癫痫患儿脑组织中的表达及意义。

1 资料和方法

1．1病例选择从驻马店市第一人民医院难治性癫痫脑库中选取11例患儿的颞叶脑组织。所有脑组织样本是在难治性癫痫患儿手术治疗中获得。使用脑电图定位判断脑组织是否异常放电并切除异常放电的脑组织，使用电极检测周围组织是否切除干净，使用Engel评分标准评价治疗效果。对照组11例颞叶标本，为同期收治的由于外伤致头颅损伤，进行颅内减压手术等抢救治疗无效的病例，依据法律规定严格按照程序取出颞叶脑组织。所有病例满足以下条件：(1)无癫痫史；(2)既往无颅内肿瘤以及其他神经系统疾病；(3)取材部位均为颞叶组织；(4)病理切片结果表明脑组织正常；(5)获得我院伦理委员会批准并征得家属同意和签署知情同意书。

1．2方法手术取材标本分为2份，一部分立即放入液氮罐内保存用于后续蛋白免疫印迹实验，另外部分置于4%多聚甲醛，固定48 h后进行石蜡包埋用于后续免疫组化。使用免疫组化和免疫印迹等检测srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1的表达含量。

2 结果

2．1 srGAP2在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况出现颗粒状沉积或棕黄色点状沉积为srGAP2的免疫反应阳性，在正常脑组织中srGAP2的表达较弱，srGAP2主要集中在神经细胞的细胞浆和细胞膜中表达(图1A、1B)。难治性癫痫患儿脑组织中srGAP2的阳性表达率显著高于对照组(图1C、1D)。难治性癫痫患儿脑组织为0.657±0.206，正常脑组织中srGAP2的阳性细胞数/1 000个细胞为0.192±0.100(P=0.006 57) 。

蛋白质免疫印迹试验结果显示，正常脑组织中srGAP2的表达较弱，难治性癫痫患儿脑组织中srGAP2的表达较强。正常脑组织srGAP2的相对表达量0.593±0.170，难治性癫痫患儿脑组织为1.447±0.220(P=0.022 0)。见图2。

图1 srGAP2在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况(免疫组化试验，Bar=50 μm)Figure 1 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，Bra = 50 μm)

图2 srGAP2在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况(蛋白质免疫印迹试验)Figure 2 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy

2．2 γ-氨基丁酸在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况难治性癫痫患儿脑组织和正常脑组织均可见染成棕褐色的神经元，难治性癫痫患儿脑组织中和正常脑组织中均有γ-氨基丁酸能神经元表达，但难治性癫痫患儿脑组织γ-氨基丁酸能神经元表达量明显低于正常脑组织。难治性癫痫患儿阳性细胞数(106.07±27.33)个，正常脑组织阳性细胞数(178.44±28.80)个，2组脑组织的表达比较差异有统计学意义(P=0.010 8)。

2．3 MCP-1在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况阴性对照组无MCP-1的表达(图3A)，阳性对照组MCP-1的表达显著(图3B)，正常脑组织中海马和颞叶MCP-1的表达阴性(图3C、4D)，难治性癫痫患儿脑组织海马和颞叶MCP-1的表达阳性(图3E、4F)。

蛋白质免疫印迹实验结果显示，正常脑组织中MCP-1的表达较弱，难治性癫痫患儿脑组织中MCP-1的表达较强。正常脑组织srGAP2的相对表达量0.239±0.075 4，难治性癫痫患儿脑组织srGAP2的相对表达量1.979±0.372(P=0.003 62)。见图4。

3 讨论

研究表明，正常人脑组织在皮质中有少量srGAP2表达，主要位于神经细胞的胞浆以及胞膜部分，srGAP2可以抑制神经细胞迁移，参与苔藓纤维出芽过程诱导局部纤维环路生成[7，19-25]。在难治性癫痫患儿脑组织中srGAP2的表达量显著高于正常人，降低srGAP2 的表达则可以有效降低轴突和树突分支的数量[8，26-31]。srGAP2诱导丝状伪足形成，进而调解突触的生长，与其他导向因子共同作用破坏正确的神经联系，神经网络出现异常，进而可能引发癫痫[9-10，32-36]。

γ-氨基丁酸与癫痫的发生和发展有密切的关系。作为脑组织重要的抑制性神经递质，γ-氨基丁酸与近50%中枢神经系统神经元的功能相关[11，37-42]。γ-氨基丁酸介导的抑制性突触传递作用的下降是导致癫痫发生过程中神经元过兴奋性的一个重要因素，可以推测γ-氨基丁酸神经元的受损与中枢神经系统功能密切相关，癫痫的发生与γ-氨基丁酸神经元的数量存在密切联系[12-15，43-47]。研究发现，γ-氨基丁酸受体主要位于中枢部位，包含GABAB、GABAA及GABAC三种受体，GABAA受体是影响意义最大的一种[16-17，48-53]。GABAA受体位于中枢突触后膜，与后膜上相应的抗体结合，通过动作电位使细胞膜内电位增加而出现超极化现象，形成早期抑制性突触后电位，可能在癫痫的发病机制中发挥重要作用[18]。

MCP-1作为一种细胞趋化因子，最早由神经胶质细胞瘤株分离得到。MCP-1 在癫痫发作中发挥重要作用[19-21，33]：(1)通过活化小胶质细胞介导神经炎性反应；(2)诱导粒细胞的渗透，粒细胞在脑组织可以介导炎性反应，进而加重血脑屏障的渗漏；(3)促进神经干细胞以及神经前体细胞的趋化迁移，对神经元进行有效修复；(4)作为重要的神经调质，借助于突触前机制增加神经元的兴奋性，促进突触的传递。

图3 MCP-1在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况(免疫组化试验，×400)Figure 3 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，×400)

图4 MCP-1在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况(蛋白质免疫印迹试验)Figure 4 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with intractable epilepsy

本研究显示，难治性癫痫患儿脑组织srGAP2的阳性表达率显著高于正常脑组织。难治性癫痫患儿脑组织和正常脑组织中均有γ-氨基丁酸能神经元表达，但难治性癫痫患儿脑组织γ-氨基丁酸能神经元表达量明显低于正常脑组织。正常脑组织中MCP-1的表达较弱，难治性癫痫患儿脑组织中MCP-1的表达较强。srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况与文献[22-23]报道一致。