多波长可见吸收光谱法测定畜禽肉中残留卡马西平

2019-01-29江虹吴小燕胡金来

食品与发酵工业 2019年1期

江虹,吴小燕,胡金来

(长江师范学院化学化工学院，武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

卡马西平是一种神经系统类药物，具有抗惊厥、抗外周神经痛、抗利尿、抗心律失常等作用，临床上广泛应用。但卡马西平副作用很大，如：胃部不适反应、过敏反应、头晕嗜睡、发热、恶心、呕吐、乏力、再生障碍性贫血和中毒性肝炎等。当用药过量时，卡马西平还可透过胎盘屏障，通过乳汁分泌，对孕妇和哺乳人体造成不良影响，对老年人，则可引起精神错乱、焦虑、激动不安、房室传导阻滞或心动过缓等。可见合理使用卡马西平对人体健康有着重要意义。

畜牧业中，为了预防和治疗畜禽疫病，促进畜禽快速增重、催肥，有的甚至为了达到谋取更多经济利益的目的，广泛使用各种药物，其中包括使用大量的抗生素、磺胺类及镇静、抗惊厥药物等。这些药物使用后，部分药物被分解或直接排出体外，另一部分将残留在畜禽体内，残留的药物将对食用者造成不良影响，若长时间食用含这些残留药物的食品，这些药物会在体内蓄积，当达到一定浓度，则会对机体产生毒性作用；使某些细菌产生抗药性，当发生疾病时，再用药物治疗则会相当困难；过敏反应，严重者可造成休克；造成菌群平衡失调，导致长期腹泻或引起维生素缺乏；有的残留药物还具致癌作用等。我国农业部176 号公告规定，严禁在动物饲料和饮用水中添加镇静、抗惊厥药物，在动物源食品中也不得检出此类药物。鉴于此，研究动物源性食品中残留的镇静、抗惊厥药物——卡马西平具有一定意义。目前，国内外检测卡马西平的方法主要有：高效液相色谱法[1-9]、液质联用[10-13]、荧光法[14]、分光光度法[15]、电化学法[16-19]等。已报道的分光光度法中，文献[15] 的表观摩尔吸光系数只有1.9×103L/(mol·cm)，灵敏度较低。本工作以固绿FCF作探针，采用多波长可见吸收光谱法(表观摩尔吸光系数为5.13×104～1.76×105L/(mol·cm))来研究畜禽肉中残留卡马西平的含量，尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三羟甲基氨基甲烷(Tris)：99.9%，齐一生物科技(上海)有限公司；卡马西平对照品：99.7%，中国食品药品检定研究院，批号：100142-201105；固绿FCF：99%，上海如吉生物科技发展有限公司；盐酸：AR级，重庆川东(化工)集团有限公司；猪肉(1#)、兔肉(2#)、鸭肉(3#)：市售。

Tris-HCl溶液：pH值3.0～9.5(用0.20 mol/L Tris与0.10 mol/L HCl混合，酸度计测定)；卡马西平(carbamazepine，简写为CAM)标准贮备液：准确称取适量卡马西平对照品，加少量甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用水定容，即配成质量浓度为236.3 mg/L的溶液，冰箱4℃ 保存，临用时稀释10倍；固绿FCF(fast green FCF，简写为FCF)溶液：准确称取适量固绿FCF，用水溶解后配成1.00×10-3mol/L；二次蒸馏水；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

精密酸度计：pHS-3C型，上海虹益仪器仪表有限公司；紫外-可见-近红外分光光度计：U-4100型，日本日立公司。

1.3 样品处理

取市场采购的猪(1#)、兔(2#)、鸭(3#)生鲜肉样品洗净、去皮、切条、搅碎成肉末。分别准确称取样品1# 15.000 6 g，2# 15.000 2 g，3# 15.000 5 g于离心试管中，加入10 mL甲醇，搅拌均匀后超声提取40 min(使卡马西平充分溶出),再以4 000 r/min离心20 min，取上清液，再重复提取1次，2次上清液合并，加甲醇20 mL，超声提取30 min，以4 000 r/min离心30 min(使蛋白质变性沉淀)，上清液转入100 mL烧杯中，在通风橱内100 ℃恒温水浴中浓缩至3 mL左右，即为待测样品溶液。各平行处理5份。

1.4 实验方法

取10 mL具塞比色管，准确加入0.50 mL pH 3.59 Tris-HCl溶液、适量23.63 mg/L CAM标准溶液及2.00 mL 1.00×10-3mol/L FCF溶液，用水定容，摇匀，静置10 min后，以试剂空白作参比，在分光光度计上扫描吸收光谱，记录可见光区3个明显负吸收峰处的吸光度A424、A558及A660,用单波长、双波长或三波长法作显色条件及样品分析。

2 结果与分析

2.1 二元缔合物的吸收光谱特征

由图1可见，CAM基本无吸收；FCF的酸性溶液有强吸收，λmax=625 nm，A=2.33；FCF在pH值3.59 的溶液中加入不同浓度的CAM标准溶液后，体系溶液颜色变浅，发生褪色现象，光谱曲线上出现3个明显的负吸收峰，最大、次大和相对最小的负吸收峰分别位于660 nm(红移35 nm)、558 nm(蓝移67 nm)和424 nm(紫移201 nm)。波移表明，CAM和FCF在酸性Tris-HCl介质中确实生成了新物质；再从CAM和FCF的结构看，FCF是1种三苯甲烷类的酸性染料，结构中含有3个磺酸根离子，CAM结构中有含孤对电子的氮原子，可以接受质子形成阳离子，因此，这二者间可以静电引力结合，这进一步表明CAM和FCF之间确实可以反应生成新物质。从曲线3～10 可知，随着CAM质量浓度的增加，3个负吸收波长处的负吸光强度呈线性增大，即一定质量浓度范围的CAM与新物质的吸光度绝对值(│A│)在424 nm、558 nm及660 nm处呈线性关系，服从朗伯-比尔定律。由于吸光度具有加和性，可用双波长(558 nm+660 nm)或三波长(424 nm+558 nm+660 nm)叠加法测定CAM，并服从朗伯-比尔定律，其灵敏度以可见光(visible light, VIS)区单波长法(single wavelengh method, SWO)、双波长法(double wavelength method, DWO)到三波长法(three wavelength method, TWO)依次增大。故单波长、双波长及三波长法均可用于CAM的定量测定。

1-CAM(2.36 mg/L), 水作参比;2-FCF (2.00×10-5 mol/L), 水作参比; 3～10-CAM(0.473, 0.945, 1.42, 1.89, 2.36, 2.84, 3.31, 3.78 mg/L)-FCF(2.00×10-4 mol/L), 试剂空白作参比;pH 3.59

图1 CAM-FCF的吸收光谱

Fig.1 The absorption spectra of CAM-FCF

2.2 反应条件

2.2.1 反应介质及pH值的选择

室温下，按实验方法考察了HAc-NaAc、Tris-HCl、HCl、NaOH溶液对体系在可见光区424、558及660 nm 3个波长处的吸光度绝对值(│A│)，结果表明，体系在Tris-HCl溶液中，│A│较大且重现性较好，故实验用Tris-HCl作介质。继而考察了不同pH值的Tris-HCl溶液在3个负吸收波长处的│A│，如图2所示。结果表明，pH 3.59时，│A│最大，体系有高灵敏度。实验选用pH值3.59 Tris-HCl溶液，最佳用量为0.50 mL。图2表明，TWO-VIS法的灵敏度最高，DWO-VIS次之。

1-424 nm; 2-558 nm; 3-660 nm; 4-(558+660) nm;5-(424+558+660) nm

图2 pH值对│A│的影响

Fig.2 Effect of buffer pH on │A│

2.2.2 FCF溶液浓度的选择

室温下，按实验方法考察了1.00×10-3mol/L FCF溶液在不同用量时对可见光区424、558及660 nm 3个负吸收波长处的│A│，图3所示。

1-424 nm; 2-558 nm; 3-660 nm; 4-(558+660) nm;5-(424+558+660) nm

图3 固绿FCF 溶液浓度对│A│的影响

Fig.3 Effect of fast green FCF concentration on │A│

结果表明，FCF溶液用量为2.00 mL时，│A│最大，灵敏度最高，即FCF溶液浓度为2.00×10-4mol/L时，体系│A│最大。故实验用2.00 mL 1.0×10-3mol/L FCF溶液。图3表明，TWO-VIS法的灵敏度最高，DWO-VIS次之。

2.2.3 试剂加入顺序的选择

按实验方法考察了试剂加入顺序对可见光区3个负吸收波长处的│A│。结果表明，加入顺序为Tris-HCl、CAM、FCF时，体系│A│相对最大，灵敏度最高。故实验按试剂最佳加入顺序进行。

2.2.4 反应时间的选择

在最优条件下，考察了时间对体系在可见光区3个负吸收波长处的│A│。结果表明，10 min内，反应即可进行完全。反应开始至10 min前，随着反应时间的增加，可见光区3个负吸收波长处的│A│逐渐增大，│A│-t曲线为一条斜线，说明此段时间内反应并未完全。10 min后，随着反应时间的增加，│A│不再增大，│A│-t曲线处于平稳状态，这说明10 min后反应即已完全，稳定时间至少1.0 h。故实验选在10 min后进行测定。

2.3 标准曲线

在最优条件下，按实验方法配制CAM标准系列溶液，并扫描吸收光谱，作A-ρ标准曲线，如图4所示。标准曲线相关参数见表1。

图4 卡马西平标准曲线

Fig.4 Standard curve of carbamazepine

表1 标准曲线相关参数

Table 1 Related parameters of standard curves

方法波长λ/nm回归方程ρ/(mg·L-1)相关系数/r线性范围ρ/(mg·L-1)表观摩尔吸光系数κ/(L·(mol·cm)-1)检出限ρ/(mg·L-1)定量限ρ/(mg·kg-1)SWO-VIS424A=0.002 21-0.219 4 ρ 0.999 60.05～3.85.13×1040.0500.11SWO-VIS558A=0.002 04-0.245 2 ρ0.999 70.05～3.85.71×1040.0480.11SWO-VIS660A=0.003 01-0.288 0 ρ0.999 80.05～3.86.74×1040.0460.10DWO-VIS558+660A=0.005 05-0.533 2 ρ0.999 00.05～3.81.25×1050.0240.053TWO-VIS424+558+660A=0.007 26-0.752 6 ρ0.999 90.05～3.81.76×105 0.0160.036

2.4 干扰试验

2.5 样品分析

取1#～3# 待测液(代替1.4 节中的CAM标准溶液)，分别用三波长叠加法(灵敏度相对最高)按实验方法进行分析，求待测样液中卡马西平的含量，并与高灵敏的共振瑞利散射(resonance rayleigh scattering, RRS)法测定结果相比较。同时以空白猪肉样、兔肉样及鸭肉样为样品，分别进行3个不同加标水平的回收试验，每个加标水平平行测定5份，分别计算回收率和相对标准偏差，并以此判断方法的准确度和精密度，结果见表2。