解淀粉芽孢杆菌的强启动子的克隆与鉴定

2019-01-29刘晓川蔡旭新陈华强

食品与发酵工业 2019年1期

刘晓川，蔡旭新，陈华强

(广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东肇庆，526040)

启动子是基因表达的重要作用元件，不仅在遗传代谢调控作为关键调控因子起作用，在异源基因高效表达中也有重要的地位[1-2]。芽孢杆菌表达系统是原核表达系统中的一种重要表达系统，具有外源蛋白分泌能力强、不易形成包涵体、分泌的外源蛋白易分离纯化、无致病性等特点，很多外源蛋白都在芽孢表达系统中成功表达[2-3]。挖掘性能优良的启动子对于芽孢杆菌表达系统的作用毋庸置疑。

解淀粉芽孢杆菌是一种重要工业微生物，是多种工业酶(α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶)的生产宿主[4]。以其为出发菌株挖掘强启动子不仅有助于为芽孢杆菌表达系统提供有效的调控元件，也有助于加深对该菌株的了解。

本文以β-半乳糖苷酶基因(bgaB)作为报告基因的启动子探针载体筛选解淀粉芽孢杆菌中的强启动子，捕抓到一个强度较高的串联启动子，并且该启动子成功运用于木聚糖酶基因的表达。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

启动子筛选出发菌株解淀粉芽孢杆菌XH7(BacillusamyloliquefaciensXH7)为本公司保存；大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5α购于大连Takara公司；枯草芽孢杆菌WB800 (BacillussubtilisWB800)、启动子探针质粒pBE-bgaB、表达质粒pBEP43-bgaB、pBEP43-xyn由华南理工大学生物科学与工程学院保存。表达质粒pBEP28-bgaB，pBEP28-xyn为本实验构建。

1.2 试剂

DNA聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA Ligase均购于Thermo公司；质粒提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购于OMEGA公司；X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)购于大连Takara公司；邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(oNPG)购于Sigma公司。

1.3 培养基

大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的培养均采用LB培养基，37 ℃ 200 r/min，必要时加入适当浓度的抗生素。大肠杆菌培养加入质量浓度100 ng/mL氨苄青霉素(Amp)，枯草芽孢杆菌培养加入质量浓度25 ng/mL卡那霉素(Kan)。启动子筛选平板加入终浓度0.2 mmol/L X-gal。

1.4 表达质粒的构建

以pBEP28-bgaB质粒为模板，为引物P28-F/R(表1)扩增P28片段，扩增片段5’和3’端分别带有EcoRⅠ和SalⅠ 2个限制性酶切位点，片段纯化、双酶切后连接于相同酶切位点酶切载体质粒pBEP43-xyn，连接产物转化E.coliDH5α，测序验证得到构建正确的质粒pBEP28-xyn。

1.5 枯草芽孢杆菌的转化

质粒转入枯草芽孢杆菌WB800参考电转化方法[5]。

1.6 β-半乳糖苷酶酶活测定

将重组菌株接种于LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养16 h，离心收集细胞后超声破碎细胞，测定β-半乳糖苷酶的酶活[2]。每分钟分解ONPG释放1 μmol ONP和1 μmol半乳糖所需的酶量为1个酶活单位。

1.7 SDS-PAGE分析

质量浓度为50 g/L浓缩胶和120 g/L分离胶进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色。

1.8 测序和序列分析

DNA引物合成与测序送交英潍捷基测序公司完成。序列的分析比对通过NCBI在线Web blast完成(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通过BPROM(http://linux1.softberry.com)预测启动子的启动子区的基本结构，DBTBS (http://dbtbs.hgc.jp/)分析启动子的σ因子类型。

表1 引物及核苷酸序列

2 结果与分析

2.1 启动子的克隆

启动子探针质粒pBE-bgaB(图1-a)是以β-半乳糖苷酶为报告基因的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌穿梭质粒，设计带SD序列的β-半乳糖苷酶(bgaB)基因起始密码子之前无启动子序列。MboI不完全酶切解淀粉芽孢杆菌XH7基因组，回收100～500 bp大小范围的片段如图1-b所示，纯化回收的酶切片段。探针质粒pBE-bgaB用BclI单酶切开与回收的基因组片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化后的菌涂布于添加了X-gal的启动子筛选平板上，挑取筛选平板上的蓝色菌落，并测定其β-Gal酶活。从64株阳性重组子筛选得到1株β-Gal酶活最高的菌株P28，对其进行强度验证和序列分析。

M-DL2000 DNA Marker；1,2-解淀粉芽孢杆菌XH7基因组

图1 启动子探针质粒pBE-bgaB图谱(a)和基因组DNA酶切电泳(b)

Fig.1 A map of the promoter trap plasmid pBE-bgaB (a) and total DNA partial digested (b)

2.2 筛选的启动子强度

克隆子中筛选的β-Gal酶活最高的重组菌株P28，考察其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的β-Gal酶活，如图2-a所示，P28在大肠杆菌中的β-Gal酶活为2350 Miller U/mL，在枯草芽孢杆菌中的酶活为3340 Miller U/mL，在枯草芽孢杆菌中的酶活强度与来源于枯草芽孢杆菌的组成型强启动子P43[2]的强度接近，该结果与SDS-PAGE检测的结果一致(图2-b)。结果显示在70 kDa处有清晰的条带，与目标蛋白分子量大小一致，表明在P28和P43启动子调控下的重组质粒bgaB报告基因成功表达。

M-蛋白Marker；P28-枯草芽孢杆菌WB800(pBEP28-bgaB)在24 h的蛋白样品；P43-枯草芽孢杆菌WB800(pBEP43-bgaB)在24 h的蛋白样品。

图2 启动子的β-Gal酶活测定(a)和SDS-PAGE验证(b)

Fig.2 β-Gal activities of clones in B.amyloliquefaciens(a) and SDS-PAGE analysis(b)

2.3 启动子的序列分析

对启动子P28进行测序，并与解淀粉芽孢杆菌XH7基因组序列进行比对，该片段长993 bp,有4个片段，从5’—3’的顺序是yodH-ctpA部分编码区片段(303 bp，yodH编码S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶，ctpA编码羧基末端加工蛋白酶)，gabT部分编码区片段(161 bp，编码4-氨基丁酸转氨酶)，dhaS部分编码区片段(180 bp，编码醛脱氢酶)，fbaA-tal部分编码区片段(349 bp，fbaA编码果糖二磷酸醛缩酶,tal编码转醛酶)。如图3-a所示，第2个片段和第3个片段落在gabT和dhaS基因编码框内，具有启动子活性的可能性较小，而第1个片段和第4个片段均有起始密码子前端序列，因此推测P28启动子是串联型的启动子，由启动子PctpA和启动子Ptal串联。通过softberry启动子预测P28两个串联启动子的-35区和-10区，如图3-b所示。将上述的启动子片段一(yodH-ctpA部分编码区片段，303 bp)和启动子片段四(fbaA-tol部分编码区片段，349 bp)提交DBTBS数据库分析得到，PctpA启动子是由σK因子识别调控的。σK因子是转录孢子形成Ⅳ期母细胞的基因编码[1,6]。