桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

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(浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300)

桂花(Osmanthusfragrans)自古深受国人的喜爱，作为中国十大传统名花之一，是园林绿化中常见的优良树种。桂花按开花特性可分为四季桂和秋桂，秋桂又可根据花色分为金桂(黄色至金黄色系)、银桂(黄白色至黄色系)和丹桂(橙色至橙红色系)三大品种群[1]。前人研究发现，桂花花瓣呈色的主要物质是类胡萝卜素，桂花不同品种花色的差异主要是由类胡萝卜素种类和含量的差异引起的[2-3]。银桂花瓣中，主要积累了少量的β-胡萝卜素；金桂花瓣中主要积累了叶黄素和β-胡萝卜素；丹桂花瓣中积累了大量的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素[3]。β-胡萝卜素羟化酶( β-carotene hydroxylase，HYB)是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶之一。在HYB的催化作用下，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素分别转化生成叶黄素和玉米黄质[4]，表明HYB对植物类胡萝卜素组分及其最终含量产生重要作用。目前，已从中国水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[5]、金花茶(Camellianitidissima)[6]、文心兰(Oncidium‘Gower Ramsey’)[7]等植物中分离得到HYB基因序列。本研究利用桂花转录组测序数据库[8]中Unigene序列信息，结合RT-PCR技术在桂花不同品种中克隆得到2个桂花HYB基因家族成员HYB1和HYB2的开放阅读框序列，进行其核苷酸序列和氨基酸序列对比以及进化树分析，探索其与桂花花色之间的关系，为后续桂花HYB1和HYB2基因功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试材及取样

以桂花银桂品种玉玲珑(YLL)、金桂品种金球桂(JQG)、丹桂品种堰虹桂(YHG)和四季桂品种日香桂(RXG)为试验材料，每个桂花品种铃梗期、半开期、盛开期、盛开末期的花序材料均采摘于浙江农林大学桂花资源圃。花序离开植株后迅速放入液氮中冷冻保存，后存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA的第1链的合成 总RNA提取方法参照RNAprep pure Plant Kit(天根，北京)说明书。cDNA的第1链按照Reverse Transcriptase M-MLV(Takara，大连)说明书合成后，储存于-20 ℃备用。

1.2.2HYB1和HYB2的克隆 根据前期浙江农林大学桂花新品种培育课题组已构建的桂花堰虹桂花瓣转录组数据库[8]，从中筛选出与HYB基因相关Unigene序列，设计特异性引物对(表1)，以不同品种RNA反转录的cDNA为模板，对桂花HYB1和HYB2基因最大阅读框序列进行PCR扩增。PCR反应体系为RNase-Free ddH2O 28.5 μL，LATaq0.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，PCR Buffer(Mg2+Plus)10 μL，dNTP 8 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循环35次后，72 ℃ 10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收、纯化，与pMD18-T载体(Takara)连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1 桂花HYB1和HYB2基因克隆的引物序列Tab.1 Primer sequences for cloning HYB1 and HYB2 genes of Osmanthus fragrans

1.2.3 生物信息学分析 将测序获得的序列在NCBI网站进行BLAST分析，用ORF Finder进行cDNA的开放阅读框查找，序列翻译、氨基酸序列比对采用DNAMAN 6.0软件进行。应用Expasy提供的Prot-Param在线软件预测所编码蛋白质的理论分子质量、理论等电点。用MEGA 5.1软件对HYB1和HYB2基因编码的氨基酸序列进行比对,构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 桂花HYB1和HYB2基因的克隆

运用PCR技术完成HYB1和HYB2基因的克隆，扩增产物电泳图显示，4个桂花品种HYB1和HYB2基因的PCR产物均在Marker 1 000 bp左右有1条清晰条带(图1)。通过测序得到HYB1目的片段大小为996 bp，HYB2目的片段大小为1 021 bp。

用Prot-Param在线软件预测该4个桂花品种HYB1、HYB2编码蛋白的理论分子质量、理论等电点(表2)，得出玉玲珑、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB1基因的最大阅读框序列均为909 bp，编码的氨基酸残基为302个，理论等电点为8.52～9.01，理论分子质量为33 712.12～33 828.29 u；HYB2基因最大阅读框序列为915 bp，编码的氨基酸残基为304个，理论等电点为9.17～9.28，理论分子质量为34 038.51～34 133.70 u。

泳道1～4分别表示玉玲珑、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB1基因的扩增条带；泳道5～8分别表示玉玲珑、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB2基因的扩增条带; M表示DL2000 Marker

Lines 1—4 represent amplified bands ofHYB1 gene in Yulinglong,Jinqiugui,Yanhonggui,Rixianggui,respectively;Lines 5—8 represent amplified bands ofHYB2 gene in Yulinglong,Jinqiugui,Yanhonggui,Rixianggui,respectively;M represents DL2000 Marker

图1 不同品种桂花HYB1和HYB2基因扩增结果Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification results of HYB1 and HYB2 genes in different cultivars of Osmanthus fragrans表2 不同品种桂花HYB1和HYB2基因及其编码的 蛋白质信息Tab.2 Genes and encoded protein information of HYB1 and HYB2 in different cultivars of Osmanthus fragrans

2.2 桂花HYB1、HYB2序列分析

运用DNAMAN软件将玉玲珑、金球桂、堰虹桂、日香桂的HYB1、HYB2基因的核苷酸序列比对后，发现4个桂花品种的核苷酸序列存在若干变异位点(表3和表4)，其中HYB1基因的变异位点比HYB2基因的变异位点多。4个桂花品种的HYB1、HYB2核苷酸序列变异位点分别有27、12处。

将金球桂、玉玲珑、堰虹桂、日香桂的HYB1、HYB2基因编码序列翻译成氨基酸序列，通过DNAMAN 6.0软件对比，结果表明，4个桂花品种的HYB1相似度高于99%(图2)，同样地，HYB2相似度也高于99%(图3)，且得到2组保守的组氨酸结构域HXXXXH、HXXHH，其作为催化位点，具有膜碳水化合物羟化酶的特点，在电子传递中有着重要的作用，作为保守性高的结构域，对羟化酶发挥着催化作用。4个桂花品种的HYB1、HYB2氨基酸序列的变异位点分别有8、3处(表5)。

2.3 桂花HYB1、HYB2进化树分析

在NCBI上查找其他植物HYB同源蛋白序列，运用MEGA软件将4个桂花品种的HYB1、HYB2蛋白序列与番茄(Solanumlycopersicum，GenBank登录号NP_001265981.1)、辣椒(Capsicumannuum，GenBank登录号NC_029979.1)、柿子(Diospyroskaki，GenBank登录号ACM44688.1)、美国油棕(Elaeisoleifera，GenBank登录号ABS76147.1)、玉米(Zeamays，GenBank登录号NP_001105907.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana，GenBank登录号NC_003076.8)、葡萄(Vitisvinifera，GenBank登录号AFP28800.1)、柑橘(Citrussinensis，GenBank登录号NC_023050.1)、月季(Rosachinensis，GenBank登录号XP_024191328.1)、南瓜(Cucurbitamaxima，GenBank登录号NW_019272050.1)、念珠藻(Nostoclinckia，GenBank登录号PHK38267.1)HYB蛋白序列构建进化树进行分析(图4)，4个桂花品种的HYB1与HYB2亲缘性较近，其中堰虹桂和日香桂序列的亲缘性更近。与其他植物相比，桂花HYB1与HYB2和茄科植物番茄和辣椒HYB亲缘性最高。

表3 不同品种桂花HYB1基因核苷酸序列变异位点Tab.3 Nucleotide mutation sites of HYB1 gene sequence in different cultivars of Osmanthus fragrans

表4 不同品种桂花HYB2基因核苷酸序列变异位点Tab.4 Nucleotide mutation sites of HYB2 gene sequence in different cultivars of Osmanthus fragrans

方框标出的是组氨酸结构域HXXXXH和HXXHH，下同 Boxes indicate histidine structure domains HXXXXH and HXXHH,which is the same in the next figure图2 不同品种桂花HYB1氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of HYB1 in different cultivars of Osmanthus fragrans

图3 不同品种桂花HYB2氨基酸序列比对Fig.3 Amino acid sequence alignment of HYB2 in different cultivars of Osmanthus fragrans表5 不同品种桂花HYB1和HYB2基因推导的氨基酸序列变异位点Tab.5 Amino acid residue mutation sites in encoded protein sequences of HYB1 and HYB2 genes in different cultivars of Osmanthus fragrans

品种CultivarHYB13136133197225237252266HYB2161 254 264 YLLFQFAIKSERSSJQGFQFTMRSERRLYHGVEYAIKSKKRSRXGFQYAIKRKKRS

图4 桂花HYB1、HYB2与其他物种HYB的系统发育树分析Fig.4 Phylogenetic tree of HYB1 and HYB2 from Osmanthus fragrans and HYB sequences from other species

3 结论与讨论

HYB是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶之一。蓖麻(Ricinuscommunis)、金花茶、毛竹(Phyllostachysedulis)、南丰蜜橘(Citrusreticulatavar.kinokun)等植物HYB基因陆续被分离得到，这些植物HYB基因编码303～311个氨基酸残基[6,9-12]。本研究发现，4个桂花品种HYB1基因均编码302个氨基酸残基，而HYB2基因均编码304个氨基酸残基，表明桂花存在不同HYB基因家族成员，同一HYB基因家族成员氨基酸序列长度在不同桂花品种中相同。

玉玲珑、金球桂、堰虹桂、日香桂品种HYB1、HYB2基因的核苷酸序列和氨基酸序列一致性较高，但均存在若干变异位点。4个桂花品种的HYB1核苷酸序列的变异位点有27处，氨基酸序列的变异位点有8处；HYB2核苷酸序列的变异位点有12处，氨基酸序列的变异位点有3处。前人研究报道HYB含若干个保守组氨酸[13],它们形成保守的组氨酸结构域“HXXXXH”+“HXXHH”,在催化过程中起着十分重要的电子传递作用，对羟化酶发挥着催化作用。南丰蜜橘CHY(AM408552)氨基酸序列含有2组“HXXXXH”+“HXXHH”模体[11]，这与本研究的结果相似，4个桂花品种HYB1和HYB2序列中均含有2组“HXXXXH”+“HXXHH”模体。

运用MEGA软件将4个桂花品种的HYB1、HYB2蛋白序列与其他物种HYB蛋白序列构建进化树进行分析，发现与其他植物相比，桂花HYB1与HYB2与茄科植物番茄和辣椒HYB亲缘性最高。本课题组前期分离桂花其他类胡萝卜素代谢基因OfCRTISO、OfZ-ISO1和OfZ-ISO2序列，进化树分析也发现相关类胡萝卜素代谢蛋白与茄科植物亲缘性最高[14]。此外，通过进化树分析发现，不管是HYB1还是HYB2，堰虹桂和日香桂序列均在同一小支，表明在桂花品种形成过程中，与其他品种相比，堰虹桂和日香桂亲缘性更近。氨基酸序列对比显示,堰虹桂和日香桂HYB1氨基酸序列仅存在3处差异位点，而这2个品种HYB2氨基酸序列完全一致，同样说明堰虹桂和日香桂具有更近的亲缘性。作为本研究材料的4个桂花品种中，丹桂品种堰虹桂类胡萝卜素含量最高，金桂品种金球桂类胡萝卜素含量次之，日香桂和玉玲珑类胡萝卜素含量较低[2]。虽然堰虹桂和日香桂HYB1、HYB2氨基酸序列相似，但是这2个品种花色及其类胡萝卜素含量存在差异，由此可见，桂花不同品种花色呈现与其HYB1、HYB2氨基酸序列差异无紧密关联。