中国乳菇属真菌一新记录种——思茅乳菇

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(1.江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004；2.鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业局重点实验室(江西农业大学)/江西省菌物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 330045)

乳菇属(Lactarius)是红菇科(Russulaceae)中最主要的2个类群之一，全世界已知乳菇属真菌超过600种，其中我国能够确认名称的有90个[1]。大多数乳菇属真菌通过与不同植物形成外生菌根共生关系，对植物的生长发育起促进和调控作用，在陆地森林生态系统中发挥着重要作用[2-3]。还有一些乳菇属真菌具有食、药用价值，如食用菌有松乳菇[Lactariusdeliciosus(L.ex Fr.) Gray]、橙红乳菇(LactariusakahatsuTanaka)、鸡足山乳菇(LactariuschichuensisW.F.Chiu),药用菌有辣乳菇[Lactariuspiperatus(L.) Pers.][4-5]。

近年来，DNA序列提高了乳菇属真菌物种鉴定的准确性，ITS(Internal transcribed specer)是核糖体内转录间隔区，在国内外广泛运用于新种和新纪录种的鉴定[6-10]。通过对我国乳菇的形态学及分子系统学研究，发现1个新记录种，并进行描述报道，为进一步研究我国乳菇属真菌多样性提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试标本

标本分别于2014—2018年采集于江西中医药大学和江西农业大学校园，经硅胶干燥后保存于江西中医药大学标本馆(标本号M.S.SU141、M.S.SU141-1、M.S.SU141-2、M.S.SU141-3、M.S.SU141-4、M.S.SU141-5)和鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业局重点实验室(江西农业大学)标本馆(标本编号为JXSB0590和JXSB0592)。

1.2 研究方法

1.2.1 形态学研究 标本的外部形态特征依据新鲜子实体的野外记录和照片，包括菌盖、菌褶、菌柄等结构的大小、颜色和形状，颜色的鉴定依据《Methuen handbook of colour》的方法[11]。用刀片切取观察结构所在部位的组织块，用5% KOH溶液固定和1%刚果红溶液染色，在明视野或相差视野下观察、记录、拍照和绘图。从研究标本的成熟担子果上，随机测量20个成熟担孢子。担孢子的长或宽以(a)b～c(d)表示，90%的测量数值落在b～c，a、d分别为测量数据中的最小值和最大值；担孢子的长宽比用Q表示，Qm表示多个担孢子长宽比的算术平均数±标准差[12]。并通过扫描电镜(FEI Quanta250)进一步观察孢子纹饰形态。

1.2.2 分子系统学研究 基因组总DNA提取采用生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的方法。扩增ITS片段所用的引物为ITS4/ITS5。扩增体系：PCR mix 15 μL，模板DNA 5 μL，上下游引物各1 μL，双蒸水8 μL，反应总体积为30 μL；扩增程序：94 ℃预变性2 min，变性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，进行40个循环，最后72 ℃扩增5 min，终止温度为4 ℃。PCR扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

将采集标本测得的ITS序列(表1)与NCBI中的序列进行比对，并从其中下载序列，与所测序列用Clustal X软件排序[13]。BioEdit v7.0.9用于序列的核对和编辑[14]。本研究采用最大似然法进行系统发育树的构建，最大似然法借助于RaxML v7.2.6软件完成，经1 000次重复获得统计学支持[15]，以Multifurcastenophylla作为外类群[6]。

表1 供试思茅乳菇样品ITS序列信息及GenBank登录号Tab. 1 ITS sequence information and GenBank accession number of Lactarius kesiyae

注：a.用于试验的中国样本。

Note: a.Chinese sample for study.

2 结果与分析

2.1 形态学特征描述

思茅乳菇LactariuskesiyaeVerbeken & K.D.Hyde sp.nov.,Phytotaxa,2015,207(3):215-241。

宏观特征：菌盖直径1.7～4.5 cm，幼时凸起，后渐平展至中间凹陷呈漏斗状，表面光滑，湿时黏，乳白色、暗金色至淡橘红色；边缘梳状；菌肉淡白色，厚3～5 mm；乳汁白色或透明，伤不变色；菌褶直生至延生，近白色至淡橙红色，较密，不等长，1～3 mm宽；菌柄长2.5～5.0 cm，直径0.4～1.0 cm，圆柱形，中生，乳白色或浅粉色，空心；基生菌丝体白色(图1)。

显微特征：担孢子[(5.0～)5.5～7.1(～8.0)]μm×[(5.0～)5.5～7.0(～7.5)]μm，Q=1.000～1.145，Qm=1.045 4±0.043 9，球形至近椭球形，有明显的脊纹和疣点，多数脊之间相互交叉形成不完整的网纹，淀粉质；担子棒状，四孢子，(35～42)μm×(11～15)μm，内部具圆形颗粒；侧生囊状体(40～68)μm×(5～9)μm，梭形或近纺锤形，薄壁，顶端短尖状；褶缘囊状体弯曲，直径(35～50)μm×(10～13)μm，窄纺锤形，顶端稍尖；子实层菌髓由丝状菌丝和球状或近球状末端细胞组成，末端细胞(10～19)μm ×(4～12)μm；菌盖皮层厚143～170 μm，黏性，由菌丝交叉组成；菌柄皮层厚120～150 μm，是一个由菌丝交叉形成的栅栏组织；锁状联合缺失(图2、3)。

模式种产地：越南。

生境：春、秋季散生于马尾松与阔叶树混交林中地上。

世界分布：中国、越南、泰国、韩国。

A.菌盖和菌褶特征;B.生境;C.白色乳汁;D.不变色的菌肉 A.Features of pileus and lamellae;B.Photo of habit;C.White latex;D.Unchanging context图1 思茅乳菇子实体Fig.1 Basidiocarp of Lactarius kesiyae

A.12 000倍下的孢子;B.18 000倍下的孢子 A.Spores at 12 000 times; B.Spores at 18 000 times图2 思茅乳菇担孢子电子扫描图Fig.2 SEM photoes of basidiospores of Lactarius kesiyae

A.担孢子；B.担子与侧生囊状体；C.褶缘囊状体；D.侧生囊状体；E.盖表皮层；F.柄表皮层。标尺=10 μm A.Basidiospores;B.Basidia and cheilocystidia;C.Pleuromacrocystidia;D.Cheilocystidia;E.Pilerpellis;F.Stipitipellis.Bars=10 μm图3 思茅乳菇显微特征Fig.3 Microscopic characteristic of Lactarius kesiyae

2.2 系统发育分析

采自我国的标本序列通过GenBank数据库中BLAST序列比对，与L.kesiyae序列同源性达99%，利用最大似然法构建系统发育树(图4)，结果显示，采自我国的标本与L.kesiyae聚在一个分支上，并获得100%支持率。与模式标本相比，采自江西南昌的标本M.S.Su141、141-1、141-2、141-3、141-4、141-5、JXSB0590和JXSB0592的形态特征与模式标本较一致。综合形态与分子证据，认为所采标本属于L.kesiyae。

图4 基于最大似然法构建的ITS序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequences based on maximum likelihood method

3 结论与讨论

从系统发育树上看，思茅乳菇与L.inconspicuus和L.decipiens的亲缘性较为接近，但与它们存在形态上的差异。思茅乳菇主要的识别特点是个体大小中等，整体呈浅棕橙色，在潮湿的环境下菌盖表面光滑且黏，浅棕灰色至浅棕红色，边缘梳状；乳汁乳白色或透明；担孢子具不完全网状结构；侧生囊状体较长且突出。而L.inconspicuus菌褶近延生至延生，淡黄色至亮黄色，伤变红棕色，菌柄表面褐橙色至棕色，乳汁白色，暴露后缓慢变淡黄色，担子近圆形至近棒状。L.decipiens菌盖具有黏性，边缘无条纹或近无条纹，菌褶稍下延或下延，乳汁白色，干后呈淡黄色，担孢子多球形，具有更细更明显的疣。该种于2011年由WISITRASSAMEEWONG等[7]在越南的思茅松(Pinuskesiya)林下采集到，由此把它命名为Lactariuskesiyae；2014年，LEE等[6]在韩国于赤松(Pinusdensiflora)林下采集到该种；而本次的研究标本是在江西农业大学校园内的马尾松(Pinusmassoniana)林下和江西中医药大学校园马尾松和湿地松(Pinuselliottii)混合林采集到的，本次发现扩大了该种的寄主范围。