海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生影响机理的热力学分析

周艳青，何 璐，向忠琪，赵文静，李安平，杨 英

（稻谷及副产物深加工国家工程实验室，中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

我国是大米的最大生产国和消费国，年产量可达2.1亿 t[1]。以大米淀粉为主要原料的米制品深受广大群众的喜爱，米制品的制成需要加热熟化，这其中伴随着大米淀粉的糊化，但是糊化后的大米淀粉容易发生回生，导致米制品品质发生劣变，阻碍了米制品的工业化发展，因此有必要研究解决这一问题。大米淀粉的回生过程跟普通淀粉一样可分为短期回生和长期回生：短期回生发生在淀粉糊化后的初始阶段，主要是无序的直链淀粉分子重新交联形成三维网状结构[2]；而长期回生则发生在糊化后的几周或几个月，主要是支链淀粉外层结构的短链通过氢键彼此交联重新结合形成有序的晶体结构[3-4]。目前，已有多种亲水性胶体被尝试用于控制淀粉的回生：β-葡聚糖可以降低大米淀粉的回生速率和程度[4]；黄原胶能够抑制大米淀粉的回生[5-6]；瓜尔胶能够通过与直链淀粉或者部分支链淀粉的相互作用抑制玉米淀粉的回生[7]；海藻酸钠会增加豌豆淀粉的糊化峰值黏度[8]和阻碍淀粉的重结晶进而抑制高直链玉米淀粉的回生[9]，添加氯化钙后能够降低海藻酸钠-玉米淀粉体系3 d后的回生率[10]。相比而言，从褐藻植物中提取并由α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通过α-1,4糖苷键连接而成[11]的海藻酸钠具有来源广泛、天然可食、结构简单的优点，并且已有研究结果表明海藻酸钠与氯化钙共同作用会影响大米淀粉糊的回生值[12]。但是，鲜见海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生影响的直接研究报道。

利用差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）和热重分析仪（thermogravimetric analyzer，TGA）进行热力学研究是揭示淀粉回生过程的重要而有效的手段。DSC可以通过测量淀粉回生晶体熔化所需热量反映淀粉回生的程度[13-14]，已有研究成功利用DSC分析β-葡聚糖和黄原胶对大米回生的影响[4,6]和6 种莲子淀粉的回生度及结晶成核方式[15]。TGA可以通过测量淀粉在储藏过程中水分的损失量反映淀粉回生的程度[16-17]，已有研究结果表明回生大米淀粉的水分含量会随储藏时间的延长而显著降低[18]。因此，本实验采用DSC和TGA测定大米淀粉回生的热力学特性，并探究海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生的影响机理，为利用海藻酸钠与氯化钙抑制大米淀粉回生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金龙鱼清香丝苗米 益海嘉里（南昌）粮油食品有限公司；海藻酸钠（低等黏度） 青岛岩晶生物科技有限开发公司；淀粉总量检测试剂盒 爱尔兰Megazyme公司。

1.2 仪器与设备

Q2000型DSC 美国TA公司；TGA/DSC1型TGA梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米淀粉的提取与检测

用0.2%的NaOH溶液以料液比1∶6（g/mL）浸泡6 h，将软化的大米充分粉碎过筛，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液和上层黄色物质，加入蒸馏水搅拌洗涤离心去上层物质，直至无黄色物质出现，且洗涤液pH值为中性。40 ℃烘干后研磨过1 000 目筛后，密封装袋置于干燥皿中待用。所提取淀粉样品的总淀粉、直链淀粉、水分、脂肪和蛋白质含量的测定分别参照试剂盒说明书、GB/T 15683—2008《大米 直链淀粉含量的测定》[19]、GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[20]、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[21]和GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[22]。

1.3.2 DSC测定

分别配制浓度为3 mmol/L氯化钙溶液样品（标记为C），质量分数为0.3%、0.6%和0.9%的海藻酸钠溶液系列样品（依次标记为A0.3、A0.6和A0.9）以及氯化钙（3 mmol/L）与海藻酸钠（0.3%、0.6%和0.9%）混合溶液系列样品（依次标记为A0.3C、A0.6C和A0.9C）。称取2.0 mg淀粉样品（标记为S）置于DSC坩埚中，加入4.0 mg蒸馏水、氯化钙溶液样品、海藻酸钠溶液系列样品或氯化钙与海藻酸钠混合溶液系列样品制成DSC测试样品（依次标记为S、SC、SA0.3、SA0.6、SA0.9、SA0.3C、SA0.6C和SA0.9C），密封压盖并在室温平衡24 h后用DSC进行糊化测定。将糊化后的样品置于4 ℃冰箱中存放，分别在1、3、7、21 d取样用DSC进行回生测定。DSC测试条件：以DSC空坩埚作对照，扫描温度20～100 ℃，扫描速率10 ℃/min，氮气流速10 mL/min。

1.3.3 大米淀粉回生率的计算

通过DSC测定得到大米淀粉的糊化焓ΔH和回生焓ΔHt，回生率计算见式（1）：

式中：ΔHt为t时刻淀粉的回生焓；ΔH为淀粉的糊化焓；DR为回生率/%。

1.3.4 大米淀粉回生动力学模型的建立

用Avrami模型[23]描述大米淀粉回生的结晶速率，见式（2）：

式中：φ为t时刻淀粉结晶量占极限结晶总量的百分比/%；k为结晶速率常数；n为Avrami指数。

在DSC测试中，淀粉的回生结晶率用回生焓ΔHt表示，因此φ可表示为式（3）：

式中：ΔHt为回生1、3、7、14 d样品的回生焓，t为时间；ΔH∞为回生21 d样品的回生焓；ΔH0为回生0 d的回生焓，一般ΔH0=0，则式（3）可表示为式（4）：

式（2）和式（4）相等，移项可得式（5）：

将式（5）两边取两次对数可得式（6）：

因此，计算出各时间t的ln[－ln（1－ΔHt/ΔH∞）]后，对lnt进行线性回归，即可得到Avrami指数n和速率常数k。

1.3.5 TGA测定

配制含氯化钙3 mmol/L、海藻酸钠0.6%和大米淀粉6%的悬浮液，经沸水浴糊化淀粉后制成含海藻酸钠与氯化钙的大米淀粉样品SA0.6C，将该样品储藏于4 ℃回生0、21 d后进行TGA测定，具体条件为在氮气保护下以10 ℃/min的速率将样品从50 ℃加热到800 ℃。

1.4 数据处理

运用Excel对实验数据进行处理作图，运用SPSS软件进行显著差异分析（Duncan），显著差异水平取P小于0.05，所有数据均为3 次平行测量的平均值。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉糊化热力学特性的影响

淀粉的糊化状态会影响其回生，因此首先用DSC测定海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉糊化热力学特性的影响。本实验所用大米淀粉样品的总淀粉质量分数、直链淀粉质量分数、水分质量分数、脂肪质量分数和蛋白质量分数分别为91.7%、22.8%、8.2%、0.48%和0.38%。

大米淀粉的糊化是有序晶体向无序晶体的转化过程，伴随着能量的变化，在DSC分析谱上表现为吸热峰，峰面积即为糊化焓。海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉糊化峰值温度和糊化焓的影响如图1所示。空白对照样S的糊化峰值温度为67.5 ℃，糊化焓值为12.3 J/g。与样品S相比，添加氯化钙后，SC样品的糊化峰值温度和糊化焓值分别增加了0.7 ℃（增加率1.0%）和0.6 J/g（增加率4.7%）；样品SA和SAC的糊化峰值温度和糊化焓值都随着海藻酸钠添加量的增加呈显著上升趋势（P＜0.05），其中，SA0.9的糊化峰值温度和糊化焓值分别上升0.7 ℃（增加率1.1%）和1.7 J/g（增加率14.0%），而SA0.9C的糊化峰值温度和糊化焓值分别上升1.5 ℃（增加率2.2%）和2.6 J/g（增加率21.4%）。

样品SC糊化峰值温度和糊化焓值的增加说明氯化钙对大米淀粉的糊化有一定的抑制作用。这可能是因为钙离子能够使样品中的水分活度降低，阻碍水分子渗透大米淀粉颗粒，从而导致样品的糊化温度升高[24]；Santiago-Ramos等[25]研究发现氯化钙能够升高玉米淀粉的糊化峰值温度，这与本研究的结果一致。样品SA和SAC峰值温度和糊化焓值的增加说明海藻酸钠及其与氯化钙混合物也能够在一定程度上抑制淀粉的糊化，并且海藻酸钠与氯化钙混合具有更强的抑制效果。这与众多学者的研究结果一致：赵阳等[26]的研究表明，海藻酸钠能够使小麦淀粉的糊化峰值温度和糊化焓显著升高；王雨生等[27]研究发现氯化钙会提高海藻酸钠-玉米淀粉复合体系的糊化温度；Viturawong等[28]的研究表明，添加氯化钙会提高黄原胶-大米淀粉复合体系的糊化峰值温度。由于海藻酸钠是一种亲水性胶体[29]，可通过与大米淀粉竞争水分阻碍大米淀粉的吸水溶胀，从而使得大米淀粉需要更高的温度和能量才能糊化。另外，由于海藻酸钠能与钙离子结合形成凝胶[30]，钙离子的存在会阻碍海藻酸钠分子的流动，导致海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉糊化具有协同增效的抑制作用。

图1 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉糊化峰值温度（A）和焓值（B）的影响Fig.1 Effects of sodium alginate and calcium chloride on gelatinization peak temperature (A) and enthalpy (B) of rice starch

2.2 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生焓值的影响

淀粉回生的实质是糊化后淀粉分子在降温过程中的重新排布和缔合、分子间相互聚拢形成氢键并发生凝聚作用而再次结晶的过程[31]。回生后的淀粉在DSC分析谱中会出现回生吸收峰，吸收峰的面积代表回生焓值，回生焓值越大说明淀粉的重结晶程度越高[32]。海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生焓的影响如表1所示，所有样品的回生焓值均随储藏时间的延长先快后慢地增大（P＜0.05），说明大米淀粉的重结晶程度随储藏时间的延长先快后慢地加大。当储藏时间达到21 d时，所有样品的回生焓值都趋于稳定，但样品SC的稳定值与样品S的接近，而所有SA样品的稳定值都为5.8 J/g，并且低于样品S的稳定值7.6 J/g，降低率为23.7%，说明海藻酸钠能够降低大米淀粉长期储藏的重结晶程度；在海藻酸钠添加量相同的条件下，样品SAC的回生焓值均低于样品SA，其中SA0.6C的回生焓值最低，为5.5 J/g，较样品降低了27.6%，说明氯化钙的存在增强了海藻酸钠对大米淀粉重结晶程度的降低效果。

表1 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生焓的影响Table1 Effects of sodium alginate and calcium chloride on retrogradation enthalpy of rice starch

2.3 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生率的影响

根据由DSC测得的大米淀粉的糊化焓值和回生焓值计算得到的回生率能够直接反映大米淀粉的回生程度，回生率越高说明大米淀粉的回生程度越大。海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生率的影响如图2所示，所有样品的回生率均随储藏时间的延长先快后慢地升高（P＜0.05），说明大米淀粉的回生程度随储藏时间的延长而增大。在储藏期间，样品SC的回生率先低于后略超过最后等同于样品S的回生率；当储藏时间相同时，样品SA的回生率均低于样品S，且随海藻酸钠添加量的增加而降低；当海藻酸钠添加量相同时，样品SAC的回生率均低于样品SA；当储藏时间第21天时，样品SA0.9和样品SA0.6C的回生率为同系列样品最低，分别为41.4%和39.8%，与样品S相比其降低率分别为33.9%和36.0%。

氯化钙对大米淀粉回生率随储藏时间变化的影响说明氯化钙能够减缓大米淀粉的短期回生，对长期回生没有明显的抑制效果。研究表明，钙离子能够通过与—OH结合阻碍淀粉分子间氢键的形成[24]起到抑制淀粉分子重排而延缓淀粉回生的作用，而氯离子能够通过加强淀粉分子间的氢键作用起到促进淀粉分子在回生中的重排而加速淀粉回生的作用[33-34]，因此样品SC回生率的变化可能是由短期回生中钙离子氢键结合的阻碍作用大于氯离子的加强作用，而长期回生中二者的作用效果持平引起的。Otsuka等[35]研究表明钙离子能够抑制玉米淀粉的回生，这与本研究的结果一致。

海藻酸钠及其与氯化钙混合物对大米淀粉回生率随储藏时间变化的影响说明海藻酸钠及其与氯化钙混合物能够降低大米淀粉长期储藏的重结晶程度。这与众多学者的研究结果一致：文献[9,36]研究发现海藻酸钠能够抑制普通玉米淀粉的回生；赵阳等[9]研究发现海藻酸钠阻碍淀粉的重结晶进而抑制高直链玉米淀粉的回生；王雨生等[27]研究发现氯化钙与海藻酸钠混合物使普通玉米淀粉的回生率降低。研究表明，淀粉在储藏前期发生的回生作用主要由淀粉中析出的直链淀粉分子通过氢键作用聚集结晶导致[37]，而海藻酸钠能够通过减少淀粉糊化过程中直链淀粉的析出[34]使淀粉在短期回生内形成的结晶量减少而起到抑制淀粉回生的作用，并且抑制程度随其添加量的增加而提高；随着储藏时间的延长，淀粉回生主要是由支链淀粉分子的重结晶和支链淀粉与直链淀粉的复合结晶引起的[38]，而海藻酸钠能够与析出的直链淀粉分子通过氢键作用聚集在一起[39]并填充在淀粉三维凝胶网络组织中造成空间位阻使支链淀粉分子不能进一步结合，从而起到抑制支链淀粉重结晶的作用。因此，海藻酸钠能够降低大米淀粉的回生率。另外，由于海藻酸钠能够与钙离子通过离子键作用形成具有较好保水性的凝胶[40]，因而能够更好地抑制直链淀粉的析出并在更大程度上阻碍支链淀粉的重结晶，因此海藻酸钠与钙离子混合物比海藻酸钠更能降低大米淀粉的回生率。

图2 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生率的影响Fig.2 Effects of sodium alginate and calcium chloride on retrogradation rate of rice starch

2.4 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生的影响机理

Avrami模型常被应用于描述天然高分子的结晶过程，淀粉在回生过程中形成的晶体属于天然高分子，所以现在广泛采用Avrami模型研究纯淀粉及富含淀粉体系的回生，用于描述淀粉在储藏过程中晶核的形成、生长和成熟过程[41-42]。Avrami方程中n为Avrami指数，代表不同的成核方式，n值越小成核速率越快，n＜1，为瞬间成核，1＜n＜2，为连续成核[43]；k为结晶速率常数，与晶体生长速率有关，值越大晶核的成长速率越快。郑铁松等[15]研究发现6 个品种莲子淀粉回生第14天的k值在1.058～1.304之间；朱帆等[44]研究发现8 种小麦淀粉和面粉回生第14天的k值分别在0.025～0.362与0.892～0.999之间。

海藻酸钠和钙离子对大米淀粉回生的影响机理可以利用Avrami模型进行分析，添加海藻酸钠与氯化钙的大米淀粉回生动力学方程及参数如表2所示。所有样品Avrami方程的R2都很接近于1，表明Avrami方程适用于描述添加海藻酸钠和氯化钙的淀粉回生行为。结果表明，样品S的重结晶生长为瞬间成核，说明大米淀粉重结晶所需的晶核主要形成于储藏初期；而样品SC为连续成核，且样品SA、SAC随着海藻酸钠添加量的增加由瞬间成核向连续成核转化。与样品S相比，样品SC的k值降低0.687（降低率73.0%）；随着海藻酸钠添加量的增加，样品SA、SAC的k值显著降低，SA0.9降低了0.848（降低率90.1%），SA0.9C降低0.897（降低率95.3%）。说明海藻酸钠与氯化钙能够降低大米淀粉的成核速率和重结晶的生长速率，使淀粉回生受到较大抑制。

表2 海藻酸钠与氯化钙对大米淀粉回生动力学方程与参数的影响Table2 Effect of sodium alginate and calcium chloride on kinetic equation and parameters for rice starch retrogradation

2.5 海藻酸钠与氯化钙对回生大米淀粉水分含量的影响

图3 海藻酸钠与氯化钙对回生大米淀粉水分含量的影响Fig.3 Effect of sodium alginate and calcium chloride on moisture content of retrograded rice starch

海藻酸钠与氯化钙混合物对大米淀粉回生的抑制作用可以通过TGA结果得到验证。淀粉的热重曲线有2 个台阶，第1个台阶是与淀粉回生程度密切相关的水分损失率，水分损失率越大说明淀粉的回生程度越高[18]。根据DSC结果选择长期回生中回生率最低的样品SA0.6C进行热重分析，结果表明：储藏21 d后，样品S与SA0.6C的水分含量均降低（图3），但样品S的水分损失率为72.3%，而样品SA0.6C的水分损失率为9.3%，比样品S的水分损失率减少87.1%，说明海藻酸钠与氯化钙混合物对大米淀粉的长期回生具有较好的抑制作用。

3 结 论

海藻酸钠与氯化钙能够抑制大米淀粉的糊化；氯化钙能够抑制大米淀粉的短期回生，对长期回生没有显著性影响；海藻酸钠及其与氯化钙混合物能够抑制大米淀粉的回生进程，且海藻酸钠添加量为0.6%混合物的抑制效果更好；海藻酸钠与氯化钙能够降低大米淀粉的成核速率和重结晶的生长速率；海藻酸钠与氯化钙混合物能够降低回生大米淀粉的水分损失率。