基于顶空气相色谱-离子迁移谱技术的冷冻猪肉贮藏时间快速判别方法

王 辉，田寒友，李文采，邹 昊，刘 飞，白 京，李家鹏，陈文华，乔晓玲

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京食品科学研究院，北京 100068）

冷冻贮藏是一种在一定贮藏时间内维持猪肉良好品质状态的常规贮藏方法，可以最大程度地抑制和减缓与猪肉腐败变质相关的生理生化反应。在长时间冷冻贮藏过程中，蛋白质氧化、脂肪氧化、微生物及冰晶的传热传质等因素导致的劣变效果叠加会大大降低冷冻猪肉的感官品质、食用品质及加工性能。加之近年来发生了多起“僵尸肉”和“过期肉”事件，导致企业和民众对于冷冻猪肉贮藏时间的质疑及其食用安全性的担忧，如何判别冷冻猪肉的贮藏时间已成为亟待解决的课题。

贮藏时间的延长不仅会导致冷冻猪肉品质劣变及食用安全性下降，还会对交易价格造成较大的影响，因此国家标准和相关部委文件[1-5]对加工原料肉和应急储备肉都有明确的冷冻贮藏时间要求。通常情况下，个人食用的冷冻猪肉一般贮藏1 个月，而储备冷冻猪肉的强制轮换期为6 个月[6]，加工冷冻猪肉的保质期为12 个月。在大宗冷冻猪肉原料交易过程中，贮藏时间的长短主要是对肉色褐变、干耗、蛋白质腐败和脂肪酸败产生的气味等品质劣变的程度进行感官评定，或采用针对性较强的理化指标检测进行判断。对于劣变现象和指标的评估是基于改变整块冷冻猪肉冻结状态的基础上进行的，评判结果由于受到解冻和检测过程中多重因素的影响，极易受到认知水平和主观差异性的影响而造成误判，因此常规的感官评定和检测方法无法满足大宗交易和批量检验对评估效果及效率的要求。通过对贮藏过程中导致冷冻猪肉品质劣变的主因、劣变发生位置、劣变产生的特征性表征物质及检测方法繁简程度的分析，选择冷冻猪肉表层或浅表层脂肪氧化所产生的挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs）作为气味劣变的气体分析项。与常规检测方法相比，气体分析具有无需改变样品状态、样品耗损少、操作简单、分析快捷及数据解释能力强等特点。通过VOCs种类和浓度的变化，可获得不同贮藏时间冷冻猪肉的脂肪氧化程度和VOCs组成特征等信息，并结合化学计量法进行聚类分析以判别该分析结果是否符合对应贮藏时间的数据特征。现阶段主流的气体分析方法是气相色谱-质谱法，而该方法对于极性相近的物质及同分异构体分辨率较差，且对痕量物质的灵敏度较低。在低温条件下缓慢进行的脂肪氧化所产生的VOCs会因此不足而导致分析数据的缺失或漏检，由此导致对贮藏时间的误判。

近年，一种基于气相色谱（gas chromatography，GC）和离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）的联用技术逐渐应用于食品研究，该项技术通过整合二者在分离和检测方面的优势，形成具有高分辨率、高灵敏度、分析高效、操作简便等特点的气体快检技术。此前GC-IMS技术主要应用于对爆炸物[7]、毒品[8]、化学战剂[9]、石化产品[10]、环境质量[11]及人体健康[12]等方面的检测、分析和预警，近些年才逐渐开展在食品上的应用研究，国内外相关文献较少且主要集中于酒[13]、茶叶[14]、植物油[15-17]及掺假[18-19]等方面，且鲜见在鲜冻肉品上应用的报道。

本研究以冷冻猪IV号肉为实验原料，以冷冻猪肉的个人消费周期、储备轮换周期及加工保质期为检测时间节点，采用顶空GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GCIMS）对冷冻猪肉在不同贮藏时间内产生的VOCs进行采集和分析，利用化学计量法处理数据后进行聚类分析，使用已知贮藏时间的样品进行性能验证，并以数据可视化形式显示该方法的判别效果，为该项快检技术的实际应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验原料为新鲜宰杀并速冻后的冷冻猪IV号肉（由塑料包装膜紧密包裹），购自北京中瑞食品有限公司，存储于同一间－18℃冷库。所有分离用有机溶剂、滴定标准液及指示剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec®食品风味分析与质量控制系统（配有CTC自动顶空进样器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件及Library Search定性软件的GC-IMS系统） 德国G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及处理

检测时间设置为0、1、6、12 个月，HS-GC-IMS的取样方法为实验时从与包装膜紧密贴合的冷冻猪肉表层不同位置处刮取肉样共计5 g，装入进样瓶中备检。每次取3 份样品用于3 项指标和HS-GC-IMS分析。

1.3.2 挥发性盐基氮的检测

根据GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[20]进行检测。

1.3.3 酸价的检测

根据GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》[21]进行检测。

1.3.4 过氧化值的检测

根据GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[22]进行检测。

1.3.5 HS-GC-IMS分析

1.3.5.1 自动进样器条件

孵化温度55 ℃；孵化时间5 min；进样方式为顶空进样；加热方式为振荡加热；振荡速率500 r/min；进样针温度85 ℃；进样量500 μL，不分流；清洗时间0.5 min。

1.3.5.2 GC条件

FS-SE-54-CB-0.5石英毛细管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；色谱柱温度40 ℃；载气为N2（纯度≥99.999%）；载气流速程序：初始流速2.0 mL/min，3 min内线性升至17.0 mL/min，5 min内线性升至100.0 mL/min，保持7 min；运行时间15 min。

1.3.5.3 IMS条件

漂移管长度98 mm；管内线性电压500 V/cm；漂移管温度45 ℃；漂移气为N2（纯度≥99.999%）；漂移气流速150 mL/min；放射源：β射线（氚，3H）；离子化模式：正离子。

1.4 数据处理

采用设备自带Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件及Library Search定性软件对冷冻猪肉中的VOCs进行采集和分析，并采用Matlab R2014a进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及K均值聚类分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中冷冻猪肉的品质变化

图1 贮藏过程中冷冻猪肉挥发性盐基氮、酸价及过氧化值变化情况Fig.1 Changes in TVB-N content, AV and POV of pork during frozen storage

通常情况下，对于冷冻猪肉的品质变化主要采用国家标准中的挥发性盐基氮法来检验，并以酸价及过氧化值辅助评估[23]，由此判断冷冻猪肉的蛋白质腐败[20]和脂肪酸败[24]程度。如图1所示，挥发性盐基氮、酸价、过氧化值的相关系数R2分别为0.981 6、0.842 2、0.785 5，均与贮藏时间有相对较好的相关性。挥发性盐基氮、酸价和过氧化值均可在一定程度上作为表征品质劣变[23,25]的指标来判断冷冻猪肉的贮藏时间，但在实际操作过程中，环境因素和人为因素对冷冻猪肉的解冻、粉碎、检测目标物提取及滴定分析等环节的影响会导致检测值发生不同程度的偏差，因此样品状态变化、操作步骤繁琐、前处理和检测时间长、对人员技术要求高等缺陷限制了以上3 个指标在批量冷冻猪肉交易和检测中的应用。

2.2 不同贮藏时间冷冻猪肉的HS-GC-IMS分析

随着速冻技术、低温恒湿贮藏技术和复合包装技术在冷冻贮藏中的应用，温度和湿度波动导致冰晶以水蒸气的形式在冷冻猪肉表面与环境之间发生的传热传质过程，受到具有阻水阻气特性的外包装膜和外包装箱构成的内环境的缓冲保护，冰晶升华现象减弱，使干耗现象导致的多孔脱水活化层向肉品内部移动的趋势受到抑制，因此作为品质劣变主因的脂肪氧化主要作用于冷冻猪肉的表层或浅表层[26-27]。HS-GC-IMS分析时，以冻结状态提取样品表层或浅表层组织进行顶空进样，最大程度地保护脂肪氧化产生的VOCs组分特征，避免样品中易挥发物质由于外界温度波动而导致的损失，确保分析数据的准确性和稳定性。

图2 不同贮藏时间冷冻猪肉的HS-GC-IMS谱图（a）和三维谱图（b）比较Fig.2 Comparison of 3D HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

图2a中纵坐标为GC分离时VOCs的保留时间，横坐标为IMS分离时VOCs相对于反应离子峰的漂移时间。图2b中第三维坐标为VOCs在IMS中的离子峰强度。HS-GCIMS根据样品中复杂VOCs组分与色谱柱固定相之间作用力强弱进行初步GC分离，不同保留时间流出的组分以气态分子的形式被离子源软电离后形成分子离子群，由于组分离子在质量、碰撞截面和电荷数等因素上的差异，在环境气压下由周期性离子脉冲驱动先后进入线性漂移电场并获得不同的迁移速率并进行二次分离，通过获取离子漂移时间和离子峰强度可分别对各组分进行定性和定量分析。从图2可看出，由于没有猪肉热加工时所呈现的复杂风味物质体系，冷冻猪肉中VOCs在600 s内完成GC分离，30 ms内完成IMS分离且分离度较高，图2a中A框和B框内GC分离时保留时间较近的物质在IMS中较好地分离。

由图2可以看出，不同贮藏时间冷冻猪肉VOCs的差异主要表现在离子峰的位置、数量、强度及时间上。从图2a中C、D、E、F、G方框中明显地看出具有相同保留时间和漂移时间的VOCs，其斑点的有无和颜色的深浅，表示物质的积累和分解程度，由此可看出不同贮藏时间的冷冻猪肉由于氧化程度的不同，VOCs的种类和浓度也随之变化。在冷冻贮藏过程中，脂肪的自动氧化和光氧化并不因为低温而停止，而是缓慢并持续地进行链式反应直到自由基相互碰撞产生惰性聚合体，在此过程中产生的氢过氧化物不断裂解成醛、酮、酸、酯及醇类等小分子挥发性有机物，随着浓度的不断增大最终导致酸败味的产生，因此可通过VOCs的种类增减和相对应物质的浓度变化来判断冷冻猪肉的贮藏时间。

2.3 冷冻猪肉中VOCs的变化分析

图3 不同贮藏时间冷冻猪肉HS-GC-IMS谱图中VOCs的图库Fig.3 Gallery pattern of VOCs in HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

图3 为FlavourSpec®系统自带LAV软件内置的Gallery Plot插件筛选出的具有明显变化规律的29 种VOCs的离子峰图库。从图3中VOCs的离子峰排列可明显看出，相同贮藏时间的冷冻猪肉含有共有VOCs，仅区别于浓度，样品组内具有明显的相似性，不同贮藏时间的冷冻猪肉含有对应时间内所特有的VOCs，样品组间则呈现出明显的差异性。根据各样品的VOCs种类和浓度进行相似度分析，见表1，组内相似度均高于90%，组间相似度则较低，说明冷冻贮藏时间越长，脂肪氧化程度越严重，组间相似度差异越大，对照组与冻贮12 个月的猪肉相似度只有60%。随着贮藏时间的延长，冷冻猪肉在A框中的VOCs含量主要呈现递减趋势，而B框中的则主要呈现递增趋势，其中B框中的14、15号及16号物质从冻贮6 个月时才开始出现，体现在图2a中C、D方框中斑点的出现，这可能是由于脂肪氧化程度不断加剧，冷冻猪肉原有VOCs通过氧化过程中不断与氢过氧化物、氢过氧化物的次级产物、脂肪氧化系统中的活性氧自由基、非血红素铁氧化系统中的高活性羟自由基或肌红蛋白氧化系统中的超铁肌红蛋白自由基发生反应而生成其他种类的VOCs[28-31]，由此也造成图3 A框中VOCs含量降低和B框中VOCs含量增加。

表1 不同贮藏时间冷冻猪肉的相似度分析Table1 Similarity analysis of frozen pork at different storage times

2.4 PCA结果

根据图3中不同种类VOCs的种类排序及离子峰强度可大致判断冷冻猪肉所处的贮藏时间，但GC-IMS的二维和三维数据图形化表达（图2）对于贮藏时间的判断仍受到观测者主观认知的影响。通过对以VOCs种类为变量的高维数组进行维度压缩，去除冗余信息和空间噪声，用少量线性无关的综合变量替代原有变量，并投影至较低维度的平面上，可便于对不同贮藏时间的冷冻猪肉进行特征差异的可视化分析。由图4可知，主成分1和主成分2的贡献率之和大于85%，数据降维后所得综合变量在二维空间即可表达原有变量的绝大部分信息。通过二维空间的数据分布差异可以直观地观察到组间和组内样品间的差异性，组内各样品相对集中于一定范围内，并与其他各组数据的成簇区域有明显的间距，这说明贮藏时间相同的样品重复性较好，不同贮藏时间的样品特异性较明显。

图4 不同贮藏时间冷冻猪肉的PCAFig.4 PCA of frozen pork at different storage times

2.5 K均值聚类分析

图5 不同贮藏时间冷冻猪肉的K均值聚类分析Fig.5 K-means clustering analysis of frozen pork at different storage times

将经PCA处理后的数据应用于聚类分析，并用已知贮藏时间的冷冻猪肉作为检验样品，检验其归类效果。由于在各贮藏时间段采样数量较少，因此采用K均值聚类算法进行分析，该方法简单高效，时间复杂度近于线性，收敛速度较快。参与聚类分析的冷冻猪肉样品的贮藏时间分别为0、1、6 个月及12 个月，因此设置簇数量K为4，采用样品与质心的平方欧氏距离最小作为样品归类的度量标准，并使用K均值++算法为每个簇设置初始质心，如图5所示。本聚类算法的运算原理为，检验样品集与第1个时间簇进行距离度量后剔除归类样品，剩余的样品再与第2个时间簇进行距离度量，剔除归类样品，以此类推，如果所剩样品与各簇质心的平方欧式距离均不满足默认最小距离时，则将该样品作为异常样品单独归为一簇，避免误判。使用4 份未参加聚类建模的冷冻猪肉作为检验样品，贮藏时间分别0、1、6 个月及12 个月。图5中无填充色表示的检验样品（T1～T4），相同形状表示检验样品与建模样品属于相同时间簇，可见根据已知贮藏时间样品所构建的聚类判别模型可有效对相同贮藏时间的样品进行归类。因此，使用此方法可对冷冻猪肉的贮藏时间是否符合国家标准及相关部门文件规定进行判别。

3 结 论

本研究分析在大宗交易和批量检测过程中不宜采用常规理化指标判别贮藏时间的原因，并根据对冷冻猪肉在贮藏过程中发生品质劣变的主因、冷冻猪肉受影响的位置、表征劣变的物质及检测方法便捷程度的分析，提出一种基于HS-GC-IMS技术的快速判别方法。该方法通过获取不同贮藏时间内冷冻猪肉表层脂肪氧化产生的VOCs组成特征，并利用PCA降维处理后的数据进行K均值聚类分析，以判别样品是否符合已知贮藏时间冷冻猪肉所特有的数据特征，结果表明不同贮藏时间的样品归类效果良好。

冷冻猪肉在企业冷库中贮藏时，由于人为因素和不可预见因素，如移库、出货、停电等，冷库中的温度和湿度波动较大且持续时间较长，冷冻猪肉的VOCs特征会偏离正常贮藏时所具备特征。因此，后期的主要工作是，分析正常冷冻贮藏条件下与温湿度波动条件下，不同贮藏时间冷冻猪肉的脂肪氧化所导致的VOCs种类差异和变化规律，并建立二者的关系校正模型以避免对贮藏时间判别分析时造成误判。

此外，通过设置多个检测时间节点，获取线性贮藏时间内冷冻猪肉VOCs的组分信息并增加采样数量，不仅可以增强判别模型的容变性和稳健性，还可由此建立判别冷冻猪肉品质等级的数据库，为大宗冷冻猪肉交易的价格制定及贮藏时间的真伪判定提供理论依据和数据支持。