南豆腐加工过程中品质及蛋白质结构的变化

赵 雷，朱 杰*，苏恩谊，杨浩文，胡卓炎，李 琳*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.东莞理工学院化学工程与能源技术学院，广东 东莞 523808）

南豆腐又称石膏豆腐，与北豆腐相比，其质地软嫩、细腻，色泽偏白亮，是我国传统的大豆制品，具有丰富的营养价值和独特的风味，深受消费者欢迎。作为传统中式食品，目前工业化标准单元操作逐渐取代家庭作坊式的生产模式，豆腐工业化加工单元操作与传统家庭式的操作工艺稍有不同，主要工序包括原料大豆的浸泡、磨浆、过滤、点脑、蹲脑和成型等，最终豆腐产品为大豆蛋白的凝胶产物[1]。

到目前为止，国内外学者已对大豆理化指标、豆腐加工工艺及豆腐凝胶形成进程的变化与豆腐品质关联等方面进行了一定的研究。在大豆理化指标方面，不同品种大豆中蛋白质含量[2-3]、油脂含量[4]、植酸含量[5]、7S亚基与11S亚基的比例[6]、7S亚基和11S亚基含量[7]等与豆腐的得率、品质等指标之间存在着密切的联系。在加工工艺优化方面，豆腐的产量、质地、口感、外形、色泽等都受到成型工序的影响，李小雅等发现当磨浆料液比为1∶7、凝固温度80 ℃、0.6 mol/L MgCl2溶液添加量为18 mL/L、凝固时间为20 min时，豆腐出品率和保水性均最高[8]。吴超义等发现在MgCl2溶液质量分数为0.4%、谷氨酰胺转氨酶添加量为7 U/g时，全豆盐卤充填豆腐成型完好，凝胶强度较高[9]。刘昱彤等发现，全豆豆浆在加热至90 ℃、保温10 min时，全豆豆腐凝胶强度最佳[10]。在豆腐凝胶方面，大豆蛋白的变性和凝胶体系的形成是影响豆腐品质的关键因素，蛋白质的结构决定其功能特性，尤其是蛋白质的亚基和二级结构。大量研究者提出凝胶的网络结构与蛋白质的二级结构是密切相关的[11]，同时蛋白质亚基的组成和数量亦影响胶体的质构特性[12-13]，从而决定了产品的最终品质。

综上所述，目前针对北豆腐加工工艺的优化及产品品质之间关联的报道较多，而针对南豆腐则鲜见报道。为了探寻南豆腐加工工艺与品质之间的关联，及大豆蛋白在加工过程中结构的变化，本研究采用传统的南豆腐加工方法，以豆腐得率、保水性、质构特性和色差为评定指标，探讨凝固剂（CaSO4）质量分数、蹲脑时间和压型力度对南豆腐品质的影响。在此基础上，探讨大豆蛋白在不同加工操作过程中结构的变化规律，以期为南豆腐标准化工业生产提供有效的技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆产地为黑龙江省伊春市，蛋白质量分数33.80%、水分质量分数7.87%，油脂质量分数19.24%。

CaSO4（食品级） 湖北美基制品有限公司；无水柠檬酸（食品级） 浙江仁和生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

3K30台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell 4-gelhandcasting system 美国BIO-RAD公司；Wizard 2.0真空冷冻干燥机 美国VirTis公司；CR-300色差计 日本Minolta公司；Tensor 37傅里叶变换红外光谱仪 美国Bruker公司；TA-XT Plus质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 豆腐制作工艺及影响因子

浸泡：将清洗后的干豆与水以质量比1∶2于常温下充分浸泡8～10 h；磨浆：每份样品湿豆质量约200 g，加入550 mL水，磨浆3 min；带渣蒸煮：倒出生浆和豆渣于锅内，浆渣同煮至熟，煮浆过程中不断搅拌并将产生的泡沫弃去；过滤：用纱布对熟浆进行2～3 次过滤，直到浆液滤干；升温点脑：将过滤后的熟豆浆升温至85 ℃，并立即与溶解后的凝固剂（CaSO4）以约45°对冲相撞混合，搅拌至均匀状态；蹲脑：静置凝固桶内的豆腐脑，在静置过程中不要碰撞或移动豆腐脑以免其蛋白质网状结构受到破坏，影响豆腐成型；压制成型：将蹲脑后的豆腐脑倒入压型模具内（14 cm×14 cm×8 cm），压出多余的黄浆水。

选取凝固剂质量分数（0.5%～3.0%）、蹲脑时间（10～50 min）、压型力度（2.0～7.0 g/cm2）为加工因素（水平），探讨不同加工工艺对豆腐品质的影响。选取凝固剂质量分数为变量因素时，固定蹲脑时间30 min、压型力度3.0 g/cm2；选取蹲脑时间为变量因素时，固定凝固剂质量分数1.2%、压型力度3.0 g/cm2；选取压型力度为变量因素时，固定凝固剂质量分数1.2%、蹲脑时间20 min。

1.3.2 豆腐得率测定

参考Liu等[14]的方法并加以修改，称量每组豆腐样品所用的湿豆质量（m1），豆腐成品制作完成后静置8 min，称量并记录成品湿质量（m2），按公式（1）计算得率。

1.3.3 保水性测定

参考Urbonaite等[15]的方法加以修改，精确称取两份4 g豆腐成品，其中一份放入105 ℃烘箱中烘干至恒质量，质量差为其所含水分质量（m1）；另一份放入带有脱脂棉的离心管中，1 000 r/min离心10 min后称质量，质量差为流失水分的质量（m2）；按公式（2）计算保水率。

1.3.4 豆腐全质构测定

将豆腐切成边长为20 mm的正方体并放在载物平台上，将探头对准样品中心位置。测定参数为：探头P/0.5、测前速率1.00 mm/s、测试速率0.50 mm/s、返回速率1.00 mm/s、压缩深度10.00 mm、触发应力5 g、压缩形变率30%。测定参数为硬度、弹性和咀嚼性。

1.3.5 色泽的测定

使用色差计测定豆腐样品表面色差。使用前先进行自动黑白板校正，每块豆腐表面随机测定3 个位置，每次取样重复3 次。记录L*值、a*值、b*值：其中L*值代表亮度，L*＝0为黑色，L*＝100为明亮；a*值代表红绿色度，＋60为红色，－60为绿色；b*值代表黄蓝色度，＋60为黄色，－60为蓝色。

1.3.6 蛋白质提取

大豆：取脱脂豆粉2 g与0.03 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液50 mL充分混合1 h（每10 min漩涡振荡一次），在4 ℃、11 000 r/min下离心30 min，弃去沉淀，保留大豆蛋白上清液，透析48 h后真空浓缩，冷冻干燥后得到大豆蛋白粉末，4 ℃保存待测；生浆、熟浆：取生浆（熟浆）10 mL与0.03 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液15 mL充分混合，后续操作同大豆蛋白提取方法；豆腐脑、豆腐、豆渣：脱脂并冷冻干燥得到粉末，后续操作同大豆蛋白提取方法。

傅里叶变换红外光谱信息的收集方式为衰减全反射（attenuated total ref l ectance，ATR）模式，ATR的晶体材料为ZnSe。采用OPUS 6.5软件进行扫描，测定参数为：扫描范围：4 000～400 cm－1；扫描次数：256 次；分辨率：4 cm－1。本实验以空ATR晶体的傅里叶变换红外光谱图为背景，并扣除CO2和空气中的水蒸气。每个样品的光谱基线校正采用Zhao Lei等[16]的方法，确保在1 800 cm－1处吸收值为0，基线相对平整。

所有样品的图谱采用Peak Fit v4.12软件进行分析。傅里叶去卷积参数的选定要确保足够多的谱带变窄，从而能在酰胺I带中完全显示出来。去卷积过滤常数和平滑常数分别取值为：44%和16%。酰胺I带中各个吸收峰的位置采用二级导数计算得到。

1.3.8 SDS-PAGE检测

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）参考Weng Wuyin等的方法[17]并有改动。配制4 mg/mL样品溶液，样品缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（15.1 g Tris、94 g 甘氨酸、5.0 g SDS和800 mL去离子水定容至1 L）。分离胶质量分数12.5%，浓缩胶质量分数5%，上样量10 μL。浓缩胶阶段电压59 V，分离胶阶段电压90 V。使用考马斯亮蓝R-250染色50 min后脱色。

1.4 数据统计与分析

实验中所有数据都是3 次测定的平均值，用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，利用Duncan’s新复极差法评价样品平均值之间的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 加工工艺条件对南豆腐得率及品质的影响

2.1.1 凝固剂质量分数

图1 凝固剂质量分数对南豆腐得率和保水性的影响Fig.1 Effect of coagulant content on the yield and water-holding capability of southern tofu

CaSO4是一种较好的凝固剂，其制作出的南豆腐得率较高，且质感柔嫩。从图1中可以明显看出，随着凝固剂质量分数的上升，南豆腐的得率有明显的改变，当凝固剂的质量分数在1.0%～1.8%之间时，南豆腐的得率相对较高，都在110.0%以上，其中最高可达到119.5%。而继续增加其质量分数则会造成豆腐得率的下降，当质量分数达到2.0%时豆腐得率最低，只有98.9%。而保水性也有类似的趋势，当凝固剂质量分数达到1.2%时，豆腐的保水率达到最大值83.4%，随着凝固剂质量分数的进一步增加，保水性虽然也呈现下降趋势，但是其变化不明显。CaSO4作为一种南豆腐加工过程中典型的凝固剂，其作用机理主要是在生浆加热的过程中导致大豆蛋白发生变性、解离、聚集等，而蛋白亚基却通过静电引力、疏水性、氢键和二硫键共同作用使蛋白质分子重新排列，从而形成可溶的蛋白-脂肪或蛋白-蛋白复合蛋白；而钙离子的加入降低了蛋白质的电荷，促进大豆蛋白发生疏水胶凝，形成南豆腐。研究发现豆腐凝胶的硬度和咀嚼性与凝固剂的添加量及豆浆中蛋白质颗粒浓度相关，凝固剂添加量越高，豆浆中蛋白质颗粒浓度越高，两者越容易结合形成网络状的三维结构，增强豆腐凝胶的强度。一旦凝固剂添加量过高，则容易在蹲脑过程中形成体积较大的豆腐凝胶，使其不能充分进入到豆浆底部，从而使底部的一部分豆浆没有参与凝固，包浆现象较为明显，凝胶体系不完整，造成咀嚼性下降；同时也会在最后的压型过程中造成这部分没有参与凝固的蛋白质随黄浆水流失，导致豆腐得率较低，保水率降低[18]。这就解释了当凝固剂的质量分数超过1.2%时豆腐的保水性下降的原因。

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表1 凝固剂质量分数对南豆腐质构特性和色泽的影响Table1 Effect of coagulant content on texture properties and color of southern tofu

从表1中可以发现，当凝固剂质量分数为0.5%时，南豆腐成型性较差，其硬度、弹性和咀嚼性都相对较低且易碎，不能满足豆腐的基本特性。随着凝固剂质量分数的增加，豆腐的硬度呈现增加的趋势，当凝固剂质量分数达到3.0%时，硬度可以达到167.53 g；与此相反，弹性则呈现下降趋势，当凝固剂质量分数为1.0%时弹性最高，为0.89。从豆腐色泽中发现，凝固剂的质量分数对豆腐的L*值影响较小，而a*值和b*值发生一定的变化，但是没有明显的规律性。当凝固剂质量分数为1.2%时，a*值达到3.90，而b*值较低，为11.13。

凝固剂的添加对豆腐凝胶质构有一定的影响，适当增加凝固剂的质量分数（凝固剂质量分数在1.0%～1.8%之间）可以提高豆腐的得率和保水性，同时随着钙离子含量的增加，蛋白分子间静电斥力减小，疏水相互作用、氢键等作用力增加，导致蛋白质结合速率和凝胶强度增加，豆腐的硬度和咀嚼性都有明显的增强[19]。一旦凝固剂质量分数过大，则可能导致蛋白质的净电荷为正，分子斥力增大，质构特性下降，在压型过程中压榨出的黄浆水增多，从而导致色度的变化。综上所述，对于南豆腐来讲，“细”、“嫩”的质构为其主要的特征，因此当凝固剂质量分数为1.2%时，制作出的豆腐得率和保水性较好，亦具有一定的硬度和咀嚼性。

2.1.2 蹲脑时间

图2 蹲脑时间对南豆腐得率和保水性的影响Fig.2 Effect of coagulation time on the yield and water-holding capacity of southern tofu

如图2所示，随着蹲脑时间的延长，南豆腐的得率和保水率均呈现先上升后下降的趋势。当蹲脑时间为40 min时得率可以达到126.5%；蹲脑时间为30 min时，保水率达到最高，为83.3%。如表2所示，南豆腐的硬度和咀嚼性会随着蹲脑时间的延长而增大，而弹性则呈下降趋势。色泽中L*值变化较小，a*值和b*值都随着蹲脑时间的延长而总体呈增大趋势。当蹲脑时间达到最大值50 min时，a*值和b*值也分别达到4.30和11.87。在一定的蹲脑时间范围（30 min）内，随着蹲脑时间的延长，可形成凝胶网络的变性蛋白分子数目增多，从而导致豆腐网络致密性提高，蛋白网络链条粗、分布均匀，网络链条之间作用力大[20]，使其失水率减小、得率增大，同时硬度和咀嚼性较好，从而达到南豆腐相对较高的得率和保水性，且硬度合适、色泽偏白，符合南豆腐本身“嫩”的特征。如果继续延长蹲脑时间，蛋白分子上的巯基发生氧化[21]，形成凝胶的巯基含量减少，导致凝胶强度、得率和保水性降低，且内部粗糙，造成硬度和咀嚼性过高、色泽偏深，达不到较好的南豆腐品质。综上所述，蹲脑时间为20 min时，南豆腐的得率、保水性较高，硬度、弹性和咀嚼性较好，色泽偏白。

表2 蹲脑时间对南豆腐质构和色泽的影响Table2 Effect of coagulation time on texture characteristics and color of southern tofu

2.1.3 压型力度

图3 压型力度对南豆腐得率和保水性的影响Fig.3 Effect of pressure on the yield and water-holding capacity of southern tofu

从图3中可以明显看出，压型力度越大，南豆腐的得率越低，而保水率则呈现先上升后下降的趋势。当压型力度为7.0 g/cm2时，得率仅为102.3%，而保水率也降低到80%以下。

表3 压型力度对南豆腐质构和色泽的影响Table3 Effect of pressure on texture characteristics and color of southern tofu

从表3中可以发现，压型力度对南豆腐质构的影响较大。随着压型力度的增加，南豆腐的硬度、弹性和咀嚼性都呈现先上升后下降的趋势，当压型力度达到4.5 g/c m2时，其分别达到最大值11 5.8 0 g、0.8 4和6 6.1 0。而色泽的变化主要集中在b*值上，压型力度达到4.5 g/c m2时，南豆腐的b*值偏高。压型操作的目的是对豆腐脑施加一定的压力，将多余的黄浆水压出，促使豆腐脑紧密结合，最终成为豆腐成品，从而减少存放过程中豆腐的脱水收缩作用。压型力度过小时，大豆蛋白凝胶网络周围的水分无法完全释放，这样导致豆腐的成型不均匀，并且容易发生脱水收缩；压型力度过大时，豆腐的凝胶结构遭到较大的破坏，黄浆水损失过多，而豆腐的保水性与黄浆水的损失量呈负相关。研究也发现在黄浆水中溶解有一定量的可溶性蛋白等营养物质，因此一旦压型过程中黄浆水流失过多，豆腐的营养价值就会降低[22]。

在传统的南豆腐加工操作过程中，当凝固剂质量分数为1.20%、蹲脑时间为20 min、压型力度为3.0 g/cm2时，豆腐得率和保水率分别达到119.5%和83.1%，所形成的豆腐具有较高的得率和保水性，硬度和咀嚼性较好，色泽偏白，品质较好。

2.2 南豆腐加工过程中蛋白质结构的变化2.2.1 蛋白质二级结构

大豆蛋白质凝胶体系是决定豆腐品质最重要的因素之一。研究发现豆腐凝胶形成过程中，蛋白质发生了重要的变化，尤其是其二级结构的变化；也有观点认为凝胶网络结构与蛋白质二级结构具有密切的关联性[11,23]。因此，本研究利用傅里叶变换红外光谱追踪加工操作过程中蛋白质的变化，构建傅里叶去卷积处理后的图谱。

图1 经过不同加工阶段后大豆蛋白酰胺I带傅里叶去卷积后高斯曲线拟合的谱图Fig.1 Fourier-deconvoluted amide I spectra by Gaussian curve fi tting of soybean protein at different stages of tofu processing

如图4所示，对于大豆蛋白，酰胺I带中经过去卷积拟合后有13 个峰出现，说明大豆蛋白二级结构相对比较复杂，而这主要是大豆蛋白成分的多样性造成的。其中最大的峰出现在1 652 cm－1处，是典型的α-螺旋结构；其次是位于1 631 cm－1和1 661 cm－1处的两个峰，分别为β-折叠和β-转角结构。经过不同加工操作处理后，蛋白质酰胺I带发生了明显的变化，生浆中蛋白质二级结构中1 628 cm－1处（β-折叠）峰值明显增大，熟浆中1 616 cm－1处（分子间β-折叠）峰消失，而加入凝固剂后的豆腐脑和豆腐中1 616 cm－1处（分子间β-折叠）峰重新出现。

表1 经过不同加工阶段后大豆蛋白中酰胺I带中不同峰的位置、含量及二级结构归属Table1 Analysis of secondary structure contents of soybean protein at different stages of tofu processing

为了更加明确地表示大豆蛋白在加工操作过程中二级结构的变化，根据文献[24-25]分别对酰胺I带去卷积后高斯曲线拟合图谱中各个峰进行指纹识别。如表4所示，未经处理的大豆蛋白的二级结构以β-折叠为主，其含量可以达到46.36%，其余依次为β-转角（18.48%）和无规卷曲（15.45%），含量最低的为α-螺旋，仅为11.27%左右，这与Li Huijing等的结论[26]相似，显示出大豆蛋白较为紧密的结构。大豆经过浸泡、磨浆加工后得到生浆，从生浆中蛋白的二级结构可以发现，1 631 cm－1（β-折叠）和1 685 cm－1（反平行β-折叠）两处峰消失，导致了β-折叠含量从46.36%下降到40.38%；与此同时，α-螺旋和β-转角的含量增加。Georget等的研究发现，蛋白质在不同水分含量的体系下，由于大量氢键的存在会导致其二级结构中β-折叠含量下降[27]。同时，在磨浆的过程中，物理破碎和挤压同样对大豆蛋白的结构造成一定的破坏，这样就造成了生浆中蛋白质由收缩的紧密结构逐渐呈现为展开状态。与生浆相比，熟浆中β-折叠含量又呈现上升趋势，尤其是在1 632 cm－1处峰的出现导致β-折叠含量上升至44.21%。这主要是由于豆浆中7S球蛋白的变性温度为（70±2）℃，11S球蛋白的变性温度为（90±2）℃[28]，而煮浆的温度要超过蛋白质的变性温度；变性后大豆蛋白的空间结构进一步展开，随着分子间次级键和共价键的作用，容易导致蛋白质发生聚集，这就是大豆蛋白的热聚集行为[29]。也有学者发现在加热的状态下，11S球蛋白的碱基亚基和7S球蛋白的β-亚基以及少量的α、α’亚基之间发生相互作用，二硫键是聚集体形成的主要作用力[30]，从而影响蛋白质的二级结构。

加入凝固剂后，钙离子的加入可以降低蛋白质电荷数量，促进大豆发生疏水凝胶作用，在疏水键、离子键、氢键的共同作用下，蛋白质分子发生重排，形成网络状的凝胶体系，从而导致蛋白质二级结构进一步改变，其中最为明显的是无规卷曲的含量从熟浆中的11.85%上升至豆腐脑中的20.46%，而同时α-螺旋、β-转角和谷氨酰胺侧链含量下降。这些现象表明蛋白质在形成凝胶的过程中，结构逐渐展开，分子发生重新排布，造成了无序结构的增加。豆腐脑还需经压型操作后才可得到成型的南豆腐，最终的豆腐中蛋白质的二级结构进一步改变，经过物理挤压后，β-折叠含量进一步升高至55.02%，而无规卷曲含量则下降到12.24%，说明无规卷曲转化为β-折叠，蛋白质结构由无序向有序转变。这主要是由于压型操作过程中挤压出了多余的黄浆水，使凝胶结构进一步稳定，并减少豆腐的脱水收缩作用。对于经过蒸煮后变性的大豆蛋白，水分的降低反而可以起到增加其结构紧密性的作用。豆渣中的蛋白质二级结构与熟浆中类似。

在整个南豆腐加工过程中，浸泡、打浆处理会导致β-折叠含量下降、β-转角含量增加，蛋白质由收缩的紧密结构逐渐呈现为展开状态；而在工艺后期，经点脑、蹲脑以及加压处理后，大豆蛋白的β-折叠结构含量不断回升，无序结构减少，蛋白二级结构构象较为稳定，从微观上阐述了加工过程对大豆蛋白结构的影响。

2.2.2 蛋白质分子质量

图5 经过不同加工阶段后大豆蛋白SDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PAGE of soybean protein at different stages of tofu processing

从图5中可以明显看出，大豆蛋白的组成主要为7S、11S球蛋白。其中7S球蛋白由β（45～52 kDa）、α（57～68 kDa）、α′（57～72 kDa）3 种亚基通过非共价作用组成，而11S球蛋白由6 个碱性亚基B（约20 kDa）和6 个酸性亚基A（约38 kDa）通过二硫键连接组成。

在加工过程中，大豆蛋白（II）与生浆蛋白（III）的条带类似，没有明显的变化，说明大豆经过浸泡、磨浆操作后对其亚基几乎没有影响。而生浆经加热后得到熟浆（IV），其条带灰度加深，尤其位于44.3 kDa附近的β亚基条带灰度加深明显，表明豆浆中的蛋白质大聚集物受热分解成小分子的可溶性蛋白[31]。熟浆法制作南豆腐，豆浆经加热后再进行过滤操作，豆渣样品（V）的电泳条带灰度明显浅于过滤后的熟浆样品（IV），这与Li Meng等的实验结果[13]相似，证明经熟浆法制作的豆制品可以保留较高的蛋白质含量。过滤后的豆浆在一定温度下与凝固剂混合、静置凝固、蹲脑，豆腐脑样品（VI）与南豆腐样品（VII）的电泳条带灰度变浅，在凝固剂的作用下，7S亚基发生变性，大豆蛋白的α和α′等亚基解离而聚集生成大分子聚合物。蹲脑过程中，大豆蛋白相互结合形成具有三维网络结构的凝胶，蛋白结构也因此发生改变。但经压榨成型后的南豆腐样品（VII）的A亚基条带和B亚基条带比豆腐脑样品（VI）加深，加压作用使得大豆蛋白中的一部分大分子聚合物再次发生解离。成型后的南豆腐还含有一定量的7S亚基以及11S亚基，说明在加工过程中蛋白质的保持率较好。

3 结 论

在传统南豆腐制作加工过程中，添加质量分数1.2%的凝固剂（CaSO4）、蹲脑时间20 min和压型力度为3.0 g/cm2时，豆腐得率和保水率分别达到119.5%和83.1%，且硬度和咀嚼性较好，色泽偏白，符合南豆腐的特性。在加工操作过程中，蛋白质结构随着工艺过程而变化，尤其大豆蛋白二级结构呈现从有序到无序再到有序的变化特性，而大豆蛋白亚基变化程度相对较小，蛋白质在加工过程中保持率较好。本研究从宏观与微观上阐明了南豆腐形成过程中主要品质和蛋白质结构的变化规律，为南豆腐的标准化工业生产提供一定的技术支持和理论依据。