饲养方式对苏尼特羊肌内脂肪沉积途径AMPK-ACC-CPT1通路和肉品品质的影响

袁 倩，王 宇，苏 琳，罗玉龙，苏日娜，赵丽华，靳 烨*

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

苏尼特羊肉具有蛋白质和矿物质等营养成分含量高、脂肪酸分布合理等诸多优点[1]。传统放牧苏尼特羊因其肉质鲜美备受关注，近些年由于草场环境恶化导致其肉质下降。因此，寻找能够改善肉品品质的饲养方式和其他改善途径迫在眉睫。我国绵羊饲养方式主要有舍饲饲养、放牧加舍饲育肥饲养、放牧饲养3 种方式。如果从羊肉的风味和蛋白质、还原糖、矿物质等营养成分含量来考虑，放牧饲养一般优于舍饲饲养[2]。但是，过度放牧使草场条件变差，从而使育肥效果变差、出栏时间加长、羊肉产量减少，降低了经济效益[3]。而放牧结合舍饲饲养则可通过人工营养搭配，调控肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）含量。营养水平对IMF含量的影响最为明显，营养水平高能增加肌内脂肪沉积水平，适当含量的肌内脂肪使肉的横切面呈大理石状，可以使肉柔软多汁、口感细嫩，并且可以改善肉及肉制品的保水性、嫩度、风味和质地[4]。吉帅等的研究表明，舍饲和半舍饲饲养可以降低羊肉膻味，其在改变羊肉感官品质的同时可以产生较好的嫩度和脂肪香味[5]。还有研究表明在放牧饲养条件下，动物可以从牧草中摄入较多的维生素（VA、VC、VE等）和多不饱和脂肪酸，以及具有抗氧化活性的矿物质等，从而影响肉品品质[6]。Akin等在不同饲养方式对Damascus羊胴体品质和肉品品质影响的研究中指出，羊所食牧草和饲料中VE含量不同导致羊肉脂肪抗氧化性能不同，进而导致肉品品质不同[7]。Priolo等的研究表明舍饲饲养羊肌肉更加柔软多汁，其保水性更好[8]。

一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通过调节动物糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢等机体代谢影响肉品品质[9-13]。目前为止，关于AMPK表达对肉品品质影响的研究大多集中在糖代谢途径中。马晓冰研究了饲养方式对宰后苏尼特羊肉AMPK、糖酵解及肉品品质的影响，结果表明AMPK活化后能够提高己糖激酶的活力，加速糖酵解进程，导致乳酸含量增加。乳酸含量是影响宰后肌肉pH值的重要因素，进而会影响羊肉品质[14]。AMPK通过对脂肪代谢的调控来影响肉品品质，其主要是通过调控脂肪代谢相关基因和酶的表达影响肌内脂肪沉积来实现的，目前对这方面的研究较少。饮食、运动、温度等因素都可以激活AMPK，活化的AMPK抑制乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），导致丙二酸单酰辅酶A含量减少，减弱了对肉毒碱脂酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase，CPT1）的抑制作用，促进脂肪酸进入线粒体进行氧化分解[13,15]，从而使脂肪沉积减少、嫩度降低，进而影响肉品品质。因此，本实验就不同饲养方式对AMPK-ACC-CPT1信号通路的影响进行研究，进而研究AMPK在蛋白水平和基因水平对脂肪代谢的调节、IMF含量及肉品品质的影响，旨在为通过调控AMPK活力改善肉品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

12 月龄健康无病放牧和舍饲饲养苏尼特羊各12 只，公母各半，由内蒙古乌拉特中旗育种园区提供。

RNAiso Plus试剂、Premix Taq Version2.0（loading dye mix）预混液、PrimeScript RT reagent试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II试剂盒、6×loading buffer、Marker DL2000 大连宝生物工程有限公司；RNase-free水北京天根生物技术有限责任公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 美国Intrivogen公司；核酸染料 北京百泰克生物技术有限公司；绵羊AMPK酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、绵羊ACC ELISA试剂盒、绵羊CPT1 ELISA试剂盒、绵羊p-AMPK ELISA试剂盒、绵羊p-ACC ELISA试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 北京eBio-top技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C1112C超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；5430R低温台式冷冻离心机、移液枪 德国Eppendorf公司；BG-power5000型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽 北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像系统、CFX96实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；普通PCR仪 美国AB公司；H2500R-2高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；pH-STAR型胴体直测式pH计德国MATTHAUS公司；制冰机 宁波格兰特制冷设备制造有限公司；快速混匀仪 常州国华电器有限公司；C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院；TC-P2A全自动测色色差计 北京奥依克光电仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

选取12 月龄健康无病放牧和舍饲饲养苏尼特羊各12 只，公母各半。放牧饲养组羊白天放牧，晚上不予补饲，牧草种类主要以乌拉特中旗荒漠化草原典型牧草（包括芨芨草、蒙古葱、中间锦鸡儿、沙生冰草、碱韭等10余种）为主。舍饲饲养组羊模拟内蒙古限牧政策下的饲养模式，即前9 个月同放牧饲养组，后3 个月舍饲育肥。育肥阶段食用农区饲草料（玉米秸秆、葵盘粉、葵花籽皮等，同时补充玉米精料）。两组实验羊在共同放牧9 个月后平均体质量大致相同。12 个月宰后选取股二头肌，一部分进行肉品品质测定，另一部分分割成小块放入冻存管后投入液氮速冻，在－80 ℃冰箱保存，待测定酶活力和质量浓度以及相关基因mRNA表达量时使用。

1.3.2 AMPK、ACC、CPT1的活力与质量浓度的测定

酶的提取：在10 mL的离心管中加入2.7 mL冰冻的PBS，取冰冻的肌肉样品0.3 g（冰冻肌肉在－80 ℃保存）。在3 000 r/min下冰浴匀浆，每个样品匀浆2～3 次，每次1 min，然后将匀浆后的样品在4 ℃、4 000 r/min下离心15 min，将上清液分装入1.5 mL离心管待测定时使用。

酶活力和质量浓度的测定（以AMPK为例）：采用生物素双抗体夹心ELISA法测定样品中AMPK的质量浓度。向预先包被了AMPK单克隆抗体的酶标孔中加入AMPK，温育后加入生物素标记的抗AMPK抗体，再与链酶亲和素-过氧化物酶结合，形成免疫复合物，经过温育和洗涤去除未结合的酶，然后加入试剂盒中底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，其颜色深浅与样品中AMPK的质量浓度呈正相关。ACC、CPT1、p-AMPK、p-ACC质量浓度的测定方法同上。

测定流程为：准备试剂、样品和标准品→加入准备好的样品和标准品，37 ℃反应90 min→洗板2 次，加入生物素抗体工作液，37 ℃反应60 min→洗板3 次，加入亲和素-过氧化物酶复合工作液，37 ℃反应30 min→洗板5 次，加入TMB显色工作液，37 ℃避光反应30 min→加入TMB终止液→30 min之内读取OD值→计算样品和标准品待测因子质量浓度。

1.3.3 实时荧光定量PCR测定

采用TRIzol法提取总RNA，采用琼脂糖凝胶法和紫外-分光光度计检测总RNA的完整性和质量浓度。cDNA采用反转录试剂盒制备，置于－20 ℃保存待用。目的基因和管家基因的引物参照NCBI中提供的序列进行设计（表1）。实时荧光定量PCR程序为：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35 个循环；72 ℃、10 min，4 ℃、24 h。按照SYBR Premix Ex Taq II试剂盒说明书中CFX96实时荧光定量PCR仪步骤操作。以AMPKα1、AMPKα2、ACC和CPT1作为实验基因，18S RNA作为管家基因，分别做3 个平行。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table1 Primers used for relative quantif i cation by real time PCR

1.3.4 肉品品质的测定

动物屠宰前禁食12 h、禁水2 h，屠宰后选择股二头肌进行肉品品质测定。pH值利用pH-STAR型胴体直测式pH计测定。在宰后45 min时测定初始pH值，记作pH0，静置排酸24 h时测定最终pH值，记作pH24[16]。将肉样修整成3 cm×3 cm×1 cm的形状，使用TC-P2A全自动测色色差仪测定肉品颜色[17]，结果分别用亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）表示。将肉样修整成2.5 cm×3 cm×5 cm大小的肉块，密封后置于75 ℃水浴锅中煮45 min，取出后待肉块变凉，顺着肌纤维方向将肉块修成大小为3 cm×1 cm×1 cm的条状，测定剪切力以表征其嫩度[18]。称取肉样30.0～50.0 g置于沸水中煮45 min，取出后置于室温自然冷却30～40 min，沥干水分再次称质量，以煮后质量与煮前质量比值的百分数表示熟肉率。IMF含量的测定采用索氏抽提法[19]。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 饲养方式对AMPK-ACC-CPT1通路相关酶质量浓度和活力的影响

p-AMPK质量浓度代表AMPK的磷酸化程度，p-AMPK质量浓度/AMPK质量浓度表示AMPK的活力，其值越大表示AMPK活力越高；相似地，p-ACC质量浓度代表ACC的磷酸化程度，p-ACC质量浓度/ACC质量浓度代表ACC活力的倒数，其值越大表示ACC活力越低[20]。

图1 饲养方式对AMPK-ACC-CPT1通路相关酶质量浓度（A）和酶活力（B）的影响Fig.1 Effects of feeding systems on enzyme concentrations （A） and activities （B） related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由图1可知，放牧饲养组股二头肌的AMPK质量浓度、AMPK活力和CPT1质量浓度显著高于舍饲饲养组，ACC活力显著小于舍饲饲养组（P＜0.05），而二者ACC质量浓度差异不显著（P＞0.05）。Kido等的研究表明，运动使p-AMPKα蛋白表达与磷酸化水平和p-ACC蛋白表达水平显著增加，表示运动在蛋白水平上可以显著增加AMPK-ACC信号转导通路的表达[21]，这与本研究结果一致。Yook等[22]对小鼠的实验和Granlund等[23]对猪的实验均证明运动在蛋白水平上可以激活AMPK，增加AMPK蛋白表达量。由于放牧饲养羊的运动量远多于舍饲饲养羊，所以放牧饲养条件下其股二头肌的AMPK质量浓度显著高于舍饲饲养。除此之外，也有研究表明放牧饲养羊所食牧草中不饱和脂肪酸含量较舍饲饲养组高，不饱和脂肪酸也有激活AMPK、促进AMPK表达的作用[24-25]。AMPK的激活对ACC的表达有抑制作用，ACC被抑制后会释放CPT1携带长链脂肪酸进入细胞膜，进而促进脂肪酸β氧化，从而减少脂肪沉积[26-27]。

2.2 饲养方式对AMPK-ACC-CPT1通路相关基因mRNA表达量的影响

2.2.1 总RNA提取结果

图2 总RNA提取结果Fig.2 Electrophoresis of total RNA

由图2可知，28S、18S处条带清晰明亮，总RNA完整无降解。经紫外分光光度计检测其吸光度均在1.8～2.1之间，可知RNA纯度高，可用于后续反转录实验。

2.2.2 AMPK-ACC-CPT1通路相关基因mRNA表达量测定结果

表2 饲养方式对AMPK-ACC-CPT1通路相关基因mRNA表达量的影响Table2 Effects of feeding systems on mRNA expression of genes related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由表2可知，放牧饲养组AMPKα2 mRNA表达量显著大于舍饲饲养组（P＜0.05），而ACC mRNA表达量显著小于舍饲饲养组（P＜0.05），AMPKα1、CPT1 mRNA表达量在两种饲养方式间无显著差异。张凯杰的研究表明，抗阻运动训练可以增加AMPKα1和AMPKα2的mRNA表达量[28]。梁俊芳在基因敲除对小鼠骨骼肌代谢的研究中发现，AMPKα2敲除后，AMPK活力显著下降，AMPK-ACC通路受阻[20]。Hu Xiyi等在限制饮食对鸡骨骼肌AMPK通路影响的研究中也发现，限制饮食可以激活骨骼肌AMPK，进而激活AMPK-ACC通路，且在基因水平上对调控此通路起主要作用的是AMPKα2[29]，与本研究结果一致。由此可见，在基因水平上对AMPK-ACC-CPT1通路起主要调控作用的是AMPKα2。

2.3 饲养方式对IMF含量的影响

图3 不同饲养方式对IMF含量的影响Fig.3 Effects of feeding systems on IMF content

由图3可知，放牧饲养苏尼特羊肉中的IMF含量显著低于舍饲饲养组（P＜0.05）。这可能是由于运动可以激活AMPK-ACC-CPT1通路，促进脂肪酸氧化，减少脂肪的合成。张洁等在对AMPK在机体骨骼肌运动代谢适应方面的研究中得出结论，运动可以激活AMPK[30]。AMPK-ACC-CPT1通路激活后，脂肪沉积减少。Niu Yanmei等在对改善小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的研究过程中也发现，有氧运动可以激活AMPKα-ACC-CPT1信号通路[31]。黄进宝在对茶多酚对肉鸡脂肪代谢的影响的研究中得出结论，AMPK-ACC-CPT1通路被激活后可以促进脂肪酸氧化，减少脂肪合成[32]。George等的研究表明舍饲饲养羊IMF含量显著高于放牧饲养羊[33]，与本研究结果一致。

2.4 饲养方式对肉品品质的影响

表3 饲养方式对肉品品质的影响Table3 Effects of feeding systems on meat quality

由表3可知，放牧饲养组羊股二头肌pH24显著低于舍饲饲养组（P＜0.05）。对于色泽来说，股二头肌的L*值和b*值均为放牧饲养组显著高于舍饲饲养组（P＜0.05）。肌肉亮度越低，肉表面反射的光越少，表明肉表面越干燥。Castellini[34]和张惠[35]等对草场散养肉鸡肌肉品质进行研究，发现由于散养组鸡肉的持水力降低，肌肉中大量水分到达肌肉表面，使得肌肉的亮度显著增加，这与本研究结果一致。本研究中放牧饲养组羊股二头肌黄度显著大于舍饲饲养组，此类的相关报道较少，其机理有待进一步研究。放牧饲养组羊股二头肌剪切力显著大于舍饲饲养组，表明放牧饲养组羊肉嫩度显著小于舍饲饲养组（P＜0.05），这可能是由于放牧可以在一定程度上激活AMPK，同时激活AMPK-ACC-CPT1通路，促进脂肪酸氧化，抑制脂肪沉积，使得放牧饲养组羊肉IMF含量显著低于舍饲饲养组，由于IMF含量与嫩度呈正相关[19]，最终使放牧饲养羊肉嫩度显著低于舍饲饲养。

3 结 论

不同饲养方式对AMPK表达具有影响，放牧饲养较舍饲饲养可以促进AMPK表达，激活AMPK-ACC-CPT1通路，减少苏尼特羊肉脂肪沉积，进而影响其色泽、嫩度等诸多肉品品质指标。在当前草场载畜力不足的情况下，研究既能改善肉品品质又能满足草场可持续发展要求的新型限牧养殖模式具有重大意义。与此同时，通过调控AMPK的活力改变肌内脂肪沉积水平，进而改善不同饲养方式下的肉品品质，为未来养殖提供了新思路。

放牧饲养组羊股二头肌AMPK质量浓度、AMPK活力和CPT1质量浓度显著高于舍饲饲养组，ACC活力显著小于舍饲饲养组（P＜0.05），说明放牧饲养可以在蛋白水平上激活AMPK-ACC-CPT1通路。放牧饲养组羊AMPKα2 mRNA表达量显著高于舍饲饲养组（P＜0.05），ACC mRNA表达量显著低于舍饲饲养组（P＜0.05），说明在基因表达水平上对AMPK-ACC-CPT1通路起主要调控作用的是AMPKα2亚基。放牧饲养苏尼特羊肉中的IMF含量显著低于舍饲饲养组（P＜0.05），说明运动可以激活AMPK-ACC-CPT1通路，促进脂肪酸氧化，减少脂肪的合成。放牧饲养组羊股二头肌剪切力显著大于舍饲饲养组（P＜0.05），表明放牧饲养组羊肉嫩度小于舍饲饲养组，说明放牧饲养可以一定程度上激活AMPK，同时激活AMPK-ACC-CPT1通路，促进脂肪酸氧化，抑制脂肪沉积，进而使得放牧饲养组羊肉IMF含量显著低于舍饲饲养组，最终使其嫩度显著低于舍饲饲养组，影响肉品品质。