广州市腹泻患者Aichi病毒的检测及基因型

文羽祺 陈雪姣 肖刚 何文巧 叶育华 李泳枝 陈清

1南方医科大学公共卫生学院流行病学系（广州 510515）；2南方医科大学第三附属医院（广州 510630）

腹泻（Diarrhea）是指每日排便次数超过3次（或平日习惯的频率），粪便稀薄，水分增加，排便量超过200 g（WHO）。在发展中国家，腹泻是五岁以下儿童的主要死因之一［1］，也是增加国家负担的重要疾病之一［2⁃4］。感染是腹泻的主要病因，尤其以病毒感染最为常见，引起腹泻的病毒有轮状病毒，诺如病毒，腺病毒，星状病毒等。

Aichi病毒属于小RNA病毒科、Kobu病毒属，是单正链RNA病毒。根据Aichi病毒3C/D区序列的差异性可把其分为A、B和C三个基因型，其中A基因型与B基因型的同源性约为90%。Aichi病毒于1989年在一例食用牡蛎而腹泻的患者粪便标本中首次发现［5］。随后在印度，芬兰，德国，澳洲，泰国等多个国家也有检出该病毒［6⁃11］。在我国的兰州，福建，上海，北京以及新疆地区的腹泻患者粪便中也有 Aichi病毒的检出［12⁃15］。相比于其他致腹泻病毒，Aichi病毒的检出率较低（0.5%～4.1%）［8］，然而，多国均有报道成年人血清中Aichi病毒抗体阳性率高达80% ～ 99%［16⁃17］，表明该病毒的感染比较普遍。因此，有关Aichi病毒与腹泻的关系有必要进行更多的研究。目前广东省人群的病毒腹泻发病率较高［18⁃19］，但目前尚未见 Aichi病毒检出的报道。为了解广州市腹泻患者中Aichi病毒的携带情况，我们开展了为期4年的基于医院腹泻病人的Aichi病毒监测。

1 材料与方法

1.1 标本从2015年1月到2018年1月，采集南方医科大学某附属医院腹泻病人的粪便标本共1 002份。在收集样本的同时，让病人或患儿监护人知情同意并填写调查问卷。

1.2 试剂、仪器病毒RNA提取试剂Trizol（Invit⁃rogen）、氯仿、异丙醇、DEPC（SIGAM）；逆转录试剂盒（Roche）；PCR试剂GoTaq Green Master Mix（Pro⁃mega）；PCR 仪（SureCycler8800）；Gel Doc 1000 凝胶成像仪（Bio⁃Rad）。

1.3 病毒RNA提取利用Trizol法提取粪便标本中的病毒RNA，将所获得的RNA标记好并保存于⁃80℃冰箱。

1.4 RT⁃PCR分子鉴定将提取的病毒RNA进行逆转录，获得cDNA。通过利用引物对（6261，6779：F5’⁃ACACTCCCACCTCCCGCCACTA⁃3’；R5’⁃GGAAGAGCTGGCTGTCAAGA⁃3’）扩增 Aichi病毒的3C/D区［5］，得到519 bp产物片段。经凝胶电泳成像，所得到的可疑阳性PCR产物送公司测序以确认其阳性情况。

1.5 基因序列分析及进化树构建将测序结果通过 Blast，BioEdit，MEGA X 等软件进行分析，并构建系统进化树。参考序列均来源于GenBank中Aichi病毒全序或部分片段。

2 结果

2.1 凝胶电泳经3C/D区RT⁃PCR的扩增，得到的PCR产物，通过凝胶电泳确认阳性样本。阳性样本的凝胶电泳图如图1。

图1 GZ1998和GZ2206凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of GZ1998 and GZ2206

2.2 Aichi病毒的检测情况

2.2.1 Aichi病毒的季节分布2015年至2018年每月腹泻患者粪便样本的采集情况以及Aichi病毒的检出情况如下表1。

表1 2015年1月至2018年1月各月份Aichi病毒在腹泻患者粪便中的检测情况Tab.1 Detection of Aichi Virus in stool samples of diarrhea patients from Jan.2015 to Jan.2018

2.2.2 Aichi病毒阳性样本检出情况在1 002份腹泻病人的粪便标本中，检出2例Aichi病毒阳性，检出率为0.2%。其中1例Aichi病毒阳性标本（GZ1998）来自一位36周岁的成年男子，采集时间为2017年3月8日，临床症状有腹泻、腹痛、腹胀、38°C低热、乏力、食欲不振，有在外就餐史并且有食用海产品，该病例同时合并诺如病毒感染；而另1例（GZ2206）来源于一位3岁腹泻儿童，采集时间为2017年7月28日，其临床诊断为“腹泻病”，除了腹泻腹痛无任何其他临床症状，无合并其他病毒感染，见表2。

表2 Aichi病毒阳性病例的基本特征Tab.2 Characteristics of positive Aichi virus cases

2.3 核酸序列测定、比对与基因分析结果本研究中的两例阳性样本，GZ1998与GZ2206，的核苷酸序列以及其推导的氨基酸序列已登录到Gen⁃Bank，其登录号分别是 MK071700⁃MK071701。阳性样本扩增的3C/D区核酸序列通过Blast软件与其他Aichi病毒的序列进行比对，其中GZ2206样本毒株与来自意大利的Aichi病毒株（KC488326.1）非常相近，其同源性达到97.1%；而GZ1998样本毒株与日本的病毒株（EF079154.1）的同源性高达99.6%。用MEGA X软件根据Aichi病毒3C/D区的核苷酸序列进行系统进化树的构建。如图3所示。结果显示，进化树中的Aichi病毒株主要分为A、B两个亚型，其中GZ1998属于A基因型，而GZ2206属于B基因型。

图3 广州市2株Aichi病毒的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of 2 positive samples of Aichi Virus

3 讨论

本研究通过PCR方法检测了某医院腹泻门诊4年来1 002份腹泻患者粪便标本中的Aichi病毒，但仅检测出2例Aichi病毒阳性样本，其检出率为0.2%，国内多数报道的检出率在0.6%～1.8%［13］，国外报道Aichi病毒的流行率在0.5%～4.1%，说明在腹泻病例中该病毒的检出较低。但也有例外，例如我国新疆地区2013年报告检出率高达18.4%，这可能与该研究所用的引物不同，导致其扩增产物仅有158 bp［15］，而其他研究，包括本研究所扩增的产物为519 bp。本研究的结果与这些结果相比，检出率最低，可能是因为样本的来源比较局限，仅来源于一家医院。虽然病毒核酸检出率低，但多国均有报道成年人血清中Aichi病毒抗体的阳性率高达 80% ～ 99%［16⁃17］，表明普通人群普遍存在该病毒的既往感染。现有的研究结果提示Aichi病毒感染力较高但对一般人的致病力较低，多数感染由于没有明显的临床表现而没有就诊，而且容易和其他病毒合并感染从而掩盖了Aichi病毒感染。

本研究中1例阳性样本（GZ2206）来源于一位3岁的男性儿童，除腹泻腹痛症状外，无恶心呕吐，发烧等症状，无牡蛎食用史，无寄生虫感染，无合并其他病毒感染。国外有研究在环境中（如下水道和地表水）检测到Aichi病毒核酸，并且通过3C/D区的PCR扩增进行检测，检出率高达93%［20］。与此同时，在多数环境中检测的Aichi病毒样本均为B基因型。这提示，该Aichi病例可能是从周围环境中感染Aichi病毒。需要在环境中检测Aichi病毒核酸的相关研究以证实。本研究的另1例阳性样本（GZ1998）来自一位36岁的成年腹泻男子，该患者不仅伴有发热、腹痛、乏力、食欲不振等症状，同时在近期食用过海产品。以往研究表明，Aichi病毒感染与食用海鲜（如：牡蛎）有关，且此类研究中所报道的Aichi病毒多属A基因型。此外，该病例还合并诺如病毒感染。诺如病毒是引起人类非细菌性腹泻的主要原因之一，其主要症状包括恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻［21⁃22］。该病人的症状基本上符合诺如病毒感染的临床表现，而其出现的乏力与食欲不振症状可能是两种病毒合并感染所导致的。两个病例的发病时间一个在3月另一个在7月，与广州其他报道的常见致泻性病毒的发病有明显季节性不同［23］，目前的结果无法证明Aichi病毒的检在时间上有季节规律。

通过Blast结果表示，本研究中Aichi病毒株GZ2206和来自意大利的病毒株同源性高达97.1%。它同时也与几株来源于中国和澳大利亚的病毒株有很高的同源性。根据序列分析和基因进化分析结果，本研究的病毒株GZ2206与来自福建、兰州、上海、北京等中国地区以及澳大利亚、意大利的Aichi病毒株聚为一簇，表明其同源性高，可能来源于同一个祖先。而病毒株GZ1998和来自日本的多个病毒株具有很高的同源性，表明该病毒株和日本流行的病毒株有较亲近的关系。该病例食用过海产品，怀疑该病毒株可能来源于受病毒污染的海产品。

本次研究证实，广州市首次检测出A、B两种基因型的Aichi病毒，并且首次在中国内地检出A基因型的Aichi病毒。目前广东省内没有该病毒的流行，但是由于本次的样本采集地点和人群较为局限，还需要更广泛的实验研究对广东省内Aichi病毒流行情况进行更进一步的研究。