核因子κB受体活化因子通过TRPC6⁃NFATc1信号通路介导足细胞损伤

张鸿 梁顺 杜玥 窦曹帅 张丽 谈锦萍 刘双信 梁馨苓 章斌，

1南方医科大学第二临床医学院（广州 510282）；2广东省人民医院肾内科，广东省医学科学院（广州510080）

足细胞脱落和足突融合是足细胞损伤的主要形式，也是肾小球疾病发生蛋白尿的主要原因之一。近年来足细胞研究［1］有大量报道，但其损伤机制未完全清楚。核因子κB受体活化因子（receptor activation of nuclear factor kappa B，Rank）是肿瘤坏死因子受体超家族I型跨膜蛋白，在破骨细胞的生成、淋巴细胞的发育［2］、乳腺癌的发生［3］等过程中发挥着至关重要的作用。在人类肾小球疾病患者及足细胞损伤动物模型中都发现足细胞损伤时，Rank 表达明显升高［4］；也有研究［5］报道Rank介导高糖诱导的足细胞损伤；这些研究提示Rank在足细胞损伤中发挥了重要的作用，但是其具体的分子机制仍不清楚。活化T细胞核因子（nu⁃clear factor of activated T⁃cells，NFAT）活化是导致足细胞损伤、凋亡、肾小球硬化的关键信号分子［6-9］。瞬时受体电位通道 6（transient receptor poten⁃tial channel 6，TRPC6）是足细胞膜通道蛋白，TRPC6的激活导致Ca2+内流增加，钙调磷酸酶活化，NFATc1去磷酸化入核增加，加剧足细胞损伤［10］。本研究拟探究Rank对足细胞的效应及其机制是否与TRPC⁃NFATc1信号通路相关。

1 材料与方法

1.1 材料RMPI 1640培养基（CORNING）；胎牛血清FBS、0.05%胰酶（Gibco）；重组小鼠γ干扰素IFN⁃γ（ProSpec）；Rank siRNA（广州锐博）；核浆蛋白提取试剂盒（凯基）；podocin抗体、Ionomycin（Sigma）；Rank、NFATc1、TRPC6抗体（Abcam）；GAPDH 抗体（Bioworld）；Synaptopodin抗体（Santa）；Histone抗体（CST）；荧光二抗488、荧光二抗555、Co⁃IP试剂盒（Thermo）；SYBR GREEN（Takara）；逆转录试剂盒、Trizol、lipofectamine 2000（Life Tech⁃nologies）。

1.2 足细胞培养条件性永生化小鼠足细胞系由美国J.RESIER教授（Rush University Medical Cen⁃ter，Chicago，IL，USA）惠赠。足细胞复苏后用含10%FBS及（2～10）×104U/L的 IFN⁃γ培养基在33℃、含5%CO2培养箱中增殖，细胞融合达到75%～85%时转入5%CO2、37℃培养箱中用5%FBS及不含IFN⁃γ的培养基中分化，在37℃培养10～12 d，足细胞分化成熟。所有足细胞实验均在分化成熟后进行。

1.3 实验分组（1）Ionomycin干预分组：Con组（空白对照组）、ionomycin组（ionomycin干预24 h）；（2）Rank沉默效率验证分组：Con组（空白对照组）、Scramble组（阴性对照组，Con⁃siRNA干预24 h）、Rank⁃siRNA#1、Rank⁃siRNA#2、Rank⁃siRNA#3（分别由对应Rank⁃siRNA干预24 h）；（3）沉默Rank表达后分组：Con组（Ionomycin干预24 h）、Scramble组（Con⁃siRNA干预24 h后加入Ionomycin干预24 h）、Rank⁃siRNA#2组（Rank⁃siRNA#2干预24 h后加入Ionomycin干预24 h）。

1.4 细胞免疫荧光细胞爬片分化成熟后，用冰甲醇固定15 min，再用Triton X⁃100透化10 min，5%胎牛血清蛋白封闭30 min，孵育一抗在4℃摇床过夜，第2天避光孵育相应二抗及细胞核染料DAPI，用防荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察。

1.5 siRNA转染将50 nmol/L siRNA、250 μL opti⁃mem培养基与8 μL lipofectamine 2000、250 μL opti⁃mem培养基混匀静置20 min，再加入含3.5 mL的无血清培养基细胞中，6 h后更换普通培养基再培养24 h。

1.6 Western印迹细胞成熟后加入蛋白裂解液（提取核蛋白加入核蛋白裂解液）刮取蛋白，用BCA法测量蛋白浓度，98℃10 min变性蛋白。制备合适浓度Western胶后，蛋白上样，80 V电泳，200 mA 120 min电转到PVDF膜上。再用5%牛奶封闭30 min，一抗4℃孵育过夜。第二天孵育相应二抗，化学发光液曝光，Image J软件分析灰度值。

1.7 荧光定量PCR用Trizol提取mRNA，测定浓度，按逆转录试剂盒说明书使mRNA逆转录成cD⁃NA，按照SYBR Green PCR试剂盒说明书操作进行荧光定量PCR检测目的基因表达。引物序列如下：Rank 正义链 5′⁃CCAGGAGAGGCATTATGAGC⁃A⁃3′，反义链 5′⁃ACTGTCGGAGGTAGGAGTGC⁃3′；GAPDH 正义链5′⁃AGGTCGGTGTGAACGGATTTG⁃3′，反义链 5′⁃TGTAGACCATGTAG TTGAGGTCA⁃3′。

1.8 免疫共沉淀（Co⁃IP）预冷PBS刮取蛋白后用细胞裂解液裂解（保留蛋白间连接），用磁珠Protein G封闭30 min，留取少量蛋白为Input组，加入Rank抗体特异吸附Rank蛋白复合体，4℃摇床过夜。加入磁珠Protein G与抗体Rank结合孵育30 min，用磁力架把磁珠Protein G⁃Rank抗体—Rank蛋白复合体拉下来，洗脱磁珠，变性蛋白，Western印迹检测TRPC6蛋白。

1.9 统计学方法采用统计软件SPSS 20.0进行统计学分析，符合正态分布计量资料用表示，组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 足细胞Rank在Ionomycin刺激下表达增多用Ionomycin干预足细胞24 h后，荧光定量PCR及Western印迹结果均显示与Con组相比，Ionomycin组足细胞中Rank表达上调（P＜0.05）。见图1A、1B。足细胞免疫荧光染色结果同样显示Ionomycin组中Rank表达明显增加。见图1C。

2.2 沉默Rank表达减少足细胞损伤通过荧光定量PCR筛选siRNA沉默效率，结果显示Rank⁃siRNA#2的沉默效率最好，同时进一步通过West⁃ern印迹验证Rank⁃siRNA#2的沉默蛋白表达效率也较高（P＜0.05）。见图2A、2B。Podocin是肾小球足细胞特异表达的跨膜蛋白，在维持足细胞形态和裂孔隔膜的结构与功能中发挥重要作用，Podocin蛋白表达下降是足细胞损伤的特征性标志［11］。通过沉默足细胞Rank表达（本研究后续沉默Rank实验均使用Rank⁃siRNA#2）后，在Ionomycin损伤刺激下，足细胞标记蛋白Podocin表达较Con组上调（P＜0.05）。见图2C。

2.3 沉默Rank表达足细胞核NFATc1表达下调沉默Rank及Ionomycin干预后，Western印迹显示Rank⁃siRNA#2组足细胞核NFATc1蛋白表达减少（P＜0.05）。见图3A。同样干预下，足细胞免疫荧光染色结果显示NFATc1主要在细胞核内表达，Rank⁃siRNA#2+Ionomycin组细胞核内 NFATc1表达减少。见图3B。

图1 Ionomycin诱导足细胞Rank表达Fig.1 The expression of RanK was upregulated in ionomycin⁃treated podocytes

图2 沉默Rank减少足细胞损伤Fig.2 Loss of RanK ameliorates podocyte injury

图3 沉默Rank后足细胞核NFATc1表达减少Fig.3 Loss of RanK decreased nuclear localization of NFATc1 in injured podocytes

2.4 Rank通过结合TRPC6调控其表达沉默TRPC6并干预Ionomycin后，Western印迹显示TRPC6蛋白表达减少（P＜0.05）。见图4A。通过Co⁃IP实验检测Rank及TRPC6间关联，结果表明Rank蛋白结合TRPC6蛋白形成复合体，且在Ionomycin刺激下形成更多Rank⁃TRPC6复合体。见图4B。

图4 Rank结合TRPC6并调控其表达Fig.4 RanK binds to TRPC6 and regulates its protein expression

3 讨论

足细胞即肾小球脏层上皮细胞，与内皮细胞、基底膜共同构成了肾小球滤过膜屏障，是肾小球滤过膜屏障的关键组成部分。足细胞损伤几乎参与了所有肾小球疾病的病理改变，也是临床治疗的重要靶点［12-13］。因此，阐明足细胞的损伤机制具有重要的科学意义。

Rank是TNF受体超家族成员，RankL是其配体，Rank/RankL/OPG（骨保护素）是调节破骨细胞的分化、发育及成熟的关键信号通路［14-15］。同时大量研究表明Rank⁃RankL在免疫系统［2］、中枢神经系统［16］、乳腺癌发生［17］等都有重要作用。近年来，研究发现Rank在足细胞中也具有重要作用。本课题组前期研究发现在IgA肾病、膜性肾病及局灶节段性肾小球硬化患者足细胞中Rank表达都比正常肾组织足细胞中增多，在嘌磷霉素（PAN）及脂多糖（LPS）造模的蛋白尿模型肾小球足细胞中也诱导Rank表达上调［4］。CHEN等［5］研究发现高糖刺激可诱导足细胞Rank表达上调。Ionomycin是一种钙离子载体，高度选择性结合钙离子以提高细胞内钙离子水平，而导致足细胞损伤［6］。本研究通过Ionomycin诱导足细胞损伤，也同样发现Ionomycin刺激下足细胞Rank在mRNA水平、蛋白水平都表达上调。足细胞免疫荧光染色结果同样显示Ionomycin刺激下足细胞Rank表达增加。

进一步探究足细胞损伤情况下Rank表达增加的效应，本研究观察肾小球足细胞特异表达的跨膜蛋白Podocin情况。Podocin具有离子通道和信号转导功能，在维持足细胞形态和裂孔隔膜的结构与功能中发挥着不可或缺的作用，在足细胞损伤情况下，标记蛋白Podocin表达减少［11］。通过筛选沉默效率高的siRNA沉默足细胞Rank表达后，在Ionomycin诱导足细胞损伤情况下沉默Rank使标记蛋白Podocin表达上调，即可部分逆转足细胞损伤。可见足细胞中Rank表达增多可加剧足细胞损伤。但Rank是通过何种机制介导足细胞损伤的，目前并不是很清楚。课题组近年来研究发现 NFATc1 是足细胞损伤的关键因子［6-7，9，18-19］。转录因子NFAT分子家族有五个亚型，即NFAT1⁃5，除NFAT5外其他成员（NFAT1⁃4）都受钙离子—钙调磷酸酶酶（calcineurin，CaN）信号通路调节［20］。在静息细胞中，NFAT主要在细胞质中保持高度的磷酸化稳定状态。当细胞受到刺激时，Ca2+内流增加，活化CaN，Ca2+/CaN使NFAT去磷酸化进入到细胞核内，NFAT与其他转录因子结合调控细胞的增殖、分化、生长［20］。在足细胞中，大量研究［7⁃8，21］表明CaN⁃NFAT信号通路的活化是导致足细胞损伤、肾小球硬化的主要重要因素。临床上对绝大多数肾小球疾病具有降尿蛋白、保护足细胞作用的环孢素A正是通过抑制CaN活化而发挥作用［22］，这也进一步证实NFAT对足细胞损伤具有重要意义。本研究沉默足细胞Rank表达后，发现Ionomycin刺激下细胞核内的NFATc1蛋白表达减少。细胞免疫荧光也证实：Ionomycin刺激下NFATc1主要在细胞核内表达明显，当沉默Rank后足细胞核内的NFATc1的表达下调。这进一步证实Rank介导足细胞损伤，其机制可能是通过正向调控NFATc1入核。

Ca2+内流激活CaN去磷酸化NFATc1，促使NFATc1入核而介导足细胞损伤，其中一个关键蛋白是足细胞膜上的通道蛋白TRPC6，TRPC6的活化程度决定了Ca2+内流的量，影响CaN⁃NFAT的活化［10］。TRPC6调节Ca2+内流活化NFAT，同时活化的NFAT也增强TRPC6表达，形成正向反馈调节加剧足细胞损伤［23］。Rank是I型膜蛋白［15］，是否与足细胞膜通道蛋白TRPC6存在关联，从而通过TRPC6⁃NFAT信号通路调节足细胞损伤。本研究在沉默Rank表达后，发现TRPC6蛋白表达也减少，Rank和TRPC6之间存在正向关联。进一步通过Co⁃IP实验发现Rank能结合TRPC6，且Ionomycin刺激能增强Rank⁃TRPC6的结合。这些结果证实：Rank通过Rank/TRPC6/NFATc1信号通路介导足细胞损伤。

本研究发现了一条新的足细胞损伤机制：Rank/TRPC6/NFATc1信号通路，阐明了Rank介导足细胞损伤的可能机制，从新的角度丰富了CaN⁃NFAT信号通路。但Rank是如何影响足细胞标记Podocin的表达改变，Rank介导足细胞损伤除了Rank/TRPC6/NFATc1是否还存在其他信号通路，后续笔者将继续探究相关问题，并在动物体内进一步证实Rank/TRPC6/NFATc1信号通路对足细胞的损伤效应，为临床治疗肾小球疾病提供新的理论基础和治疗靶点。