一个纯合子Tyr503Cys突变导致的遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系分析

周星星，李小龙，金艳慧，杨丽红，潘景业，苏看看，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

凝血因子XI（FXI）是丝氨酸蛋白酶原，由肝细胞和巨核细胞合成。其可被凝血酶激活，当凝血被外源性（组织因子）途径触发时即可启动内源性凝血途径，活化的FXI I（FXI Ia）和活化的FXI（FXIa）也可以通过切割FX I的Arg369-Ile370键来激活FX I。遗传性FX I缺陷症（OMIM 264900）为常染色体隐性遗传病，是一种罕见的出血性疾病，通常很少导致自发性出血。但根据FXI水平降低的不同，会具有不同的出血表现型，出血倾向与FXI血浆水平之间的关系尚不清楚[1]。根据FXI活性（FXI:C）和FXI抗原（FX I:Ag）水平的不同，该病可分为两型，I型为交叉反应物（cross-reacting material，CRM）阴性（FXI:C和FXI:Ag同步减少），I I型为CRM阳性（FXI:C减少，FXI:Ag正常）[2]。本研究对1例纯合F11基因突变导致的遗传性FXI缺陷症家系进行实验室表型与基因检测，并采用生物信息学相关软件对其基因突变的位点进行分析，初步探讨其分子致病机制。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，女，64岁，由于下肢运动障碍收住温州医科大学附属第一医院，而后诊断为“下肢静脉功能不全”，无其他临床症状，个人及家族成员 均没有出血倾向，肝、肾功能正常。常规凝血试验显 示活化部分凝血酶时间（activated partial thrombin time，APTT）延长为59.3 s（29.0～41.0 s）。 进一步检查发现FIX:C降至13%（82%～118%），FX I:Ag 正常，为76%（75%～125%）。其他测试指标如凝血酶原时间（pro-thrombin time，PT）、FVIII:C、FIX:C和FXII:C均在正常参考范围，初步诊断为FXI缺陷症。通常三代以内的联姻被定义为近亲婚姻。通过家系调查发现，先证者父母之间存在血缘关系，其母亲的祖母和父亲的祖父是兄妹关系，家系遗传图谱见图1。选择100名年龄22～56岁，无肝、肾功能异常，且无其他基础性疾病的健康体检者，其中男53名，女47名。本研究通过本院伦理委员会审查，征求本人同意，对上述人员采集血样。

图1 遗传性FXI缺陷症先证者家系图

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理：采集受检者外周静脉血 2.7 mL，以0.109 mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，3 000 r/min 离心10 min，上层乏血小板血浆用于凝血指标检测，并于2 h内完成，下层血细胞用于提取基因组DNA，并进行PCR扩增及测序。

1.2.2 血浆凝血指标检测：PT、APTT、FVIII:C、FIX:C、FXI:C和FXII:C等凝血指标采用一期凝固法在法国Stago STA-R全自动血凝仪上测定（配套试剂由法国Stago公司提供）；FX I:Ag采用ELISA法测定。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 PCR扩增及电泳：采用酚-氯仿法抽提受检者的外周血基因组DNA，参照文献[3]设计合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。所有PCR扩增均在25 μL反应体系中进行，包括12.5 μL PCR扩增反应物（2×）（北京天根生化科技有限公司），8 μL ddH2O，1 μL上游引物，1 μL下游引物 （10 mmol/L），2 μL基因组DNA模板（100 ng）。将DNA样品95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行30个循环，最后在Applied Biosystem热循环仪2720（美国ABI公司）上以（72±8）℃延伸10 min。将5 mL PCR扩增产物置于含Tris硼酸盐缓冲液（pH 8.3）的1.5%琼脂糖凝胶上，用GoldView I I核酸着色剂（上海蓝季科技发展有限公司）染色，通过电泳检测扩增效果。纯化后，PCR产物送上海桑尼生物工程有限公司直接测序。

1.2.4 DNA测序分析：将测序结果与GenBank数据库中F11基因序列（NG_008051.1）比对，发现突变位点后，反向测序予以证实。先扩增先证者F11基因各外显子、侧翼序列以及5’端、3’端非翻译区，发现突变位点后再扩增其他家系成员相应外显子片段。同时筛选来自相同区域共计100名（200个等位基因）健康个体来排除基因多态性。

1.2.5 氨基酸突变位点保守性与危害性分析：采用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸与其他同源物种的氨基酸序列进行比对，分析突变氨基酸在物种进化过程中的保守性。用3种在线生物信息学软件来预测突变是否影响蛋白质功能：Phenotyping-2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）以及MutationTaster（http:// www.mutationtaster.org）。FXI的蛋白质参考ID：P03951，蛋白质参考转录本ID：ENST00000403665。1.2.6 突变蛋白空间结构模型分析：以蛋白质数据库（PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do，PDB ID：1xx9）中的三维结构为基础，通过spdbv 软件和蛋白质相互作用计算器程序（http://pic.mbu.iisc.ernet.in）生成蛋白质模型。分析F11基因突变前后由氨基酸变化引起的蛋白质空间结构的改变。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果 先证者APTT为59.3 s，明显延长，FXI:C降低至13%；其母亲、女儿和儿子的APTT均有不同程度延长，FXI:C降至37%～42%。该家系5人FXI:Ag、PT均正常，见表1。FVIII:C、FIX:C和FXI I:C也均在参考范围。

表1 遗传性FXI缺陷症家系成员表型及基因型检测结果

2.2 基因突变检测结果 DNA测序分析显示，先证者F11基因第13号外显子中存在c.1562A＞G纯合错义突变，导致Tyr503Cys突变；其母亲、儿子和女儿均存在Tyr503Cys突变杂合子；妹妹是野生型。对100名健康对照者F11基因第13号外显子进行测序，均未发现c.1562A＞G，排除基因多态性，见表1和图2。

2.3 氨基酸突变位点保守性与危害性结果 通过同源序列比对，Tyr503在同源物种间高度保守。PolyPhen-2评分结果为1.000分，PROVEAN评分结果为-3.352分，均预示此突变很可能是有害突变；Mutation Taster评分结果为0.998分，预示此突变可引起相关疾病。

图2 Tyr503Cys突变测序图

2.4 突变蛋白空间结构模型分析结果 模型分析表明，野生型Tyr503与Ile370、Lys554形成2个氢 键；当突变为Cys503后其苯环消失，同时与Lys554之间新增了1个氢键，导致蛋白质结构改变，见图3。

图3 Tyr503Cys突变模型

3 讨论

本家系研究表明，先证者携带Tyr503Cys纯合错义突变，其FXI:C降低至13%，但FXI:Ag水平正常。其母亲、儿子和女儿携带Tyr503Cys杂合子，FXI:C均降低至40%左右，FXI:Ag水平正常。其妹妹为野生型Tyr503，FXI:C和FXI:Ag均正常。通过添加正常血浆混合物可以纠正FXI:C降低，由此可以确定血液中不含有针对FXI的循环抗凝剂。另外，我们没有发现其他凝血指标异常。因此，可以初步认为该突变是导致FXI:C降低的原因。根据家系图，发现儿子和女儿携带的Tyr503Cys杂合突变等位基因均来自于先证者。先证者的父母存在血缘关系，母亲是杂合子，尽管先证者父亲已故，但可以高度假设先证者的纯合等位基因分别遗传自其父亲和母亲。其遗传规律符合遗传性FXI缺陷症常见的常染色体隐性遗传特征。由此可知该突变导致了遗传性FXI缺陷症，同时为交叉反应物质阳性（CRM阳性，I I型）。

保守性分析结果显示，Tyr503在同源物种间高度保守，表明它是FXI中维持蛋白质正常功能的重要组成部分。Tyr503位于F11基因的催化结构域（催化三联体：H413-A462-S557），因此Tyr503Cys突变可能会导致FXI功能严重缺陷。有报道[4-5]指出，Tyr503残基发生移码突变（Tyr503ValfsX32）会造成FXI多肽催化结构域的破坏。3个生物信息学软件分析结果均表明Tyr503Cys是一种有害的突变，可能影响FXI蛋白质的结构和功能，从而导致疾病的发生。

FXI蛋白由625个氨基酸组成，包含36个半胱氨酸，其中除了p.Cys11，p.Cys321外，其余半胱氨酸之间形成的二硫键均与蛋白质结构直接相关，这足以说明半胱氨酸残基对FXI蛋白的重要性。MITCHELL 等[6]曾报道新产生的半胱氨酸可破坏蛋白质结构，导致其功能受损。在本研究中，催化结构域中原来的Tyr503被Cys替代，这可能会导致二硫键错配，从而影响蛋白质的功能。同时，根据表型推测，突变不会影响蛋白质的合成和分泌。此外，模型分析显示突变导致氨基酸之间的氢键改变，使得Cys503和Lys554之间产生额外1个氢键。同时突变为Cys503 后其苯环消失，导致蛋白质结构改变，引起FXI蛋白功能失调。

到目前为止，人类基因数据库共收录了225种F11基因突变类型。I I型突变类型较少，其中4例有特殊的致病机制，Ser248Asn是一种多态性，导致血小 板亲和力降低[7]；Pro520Leu一定程度上破坏了催化活性[8]；Gly555Glu大幅降低了FIX激活的速度[9]； Val371Ile影响FXI和FIX的激活[10]。而本研究中，Tyr503Cys突变替换产生了半胱氨酸残基，导致形成额外的氢键和二硫键，影响FXI蛋白的结构和功能。该突变丰富了数据库，并有助于未来对F11基因突变的研究，特别是I I型。

综上所述，本研究报道了1例中国有血缘关系的家系中发现F11基因纯合错义突变（Tyr503Cys），并对其分子发病机制进行了初步探讨，显示该突变可能是导致FXI:C下降的原因。但其确切的分子致病机制有待进一步研究。