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超声波辅助酶解提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白的工艺优化

2019-01-26王锡念徐志善孙钦军包建强

食品工业科技 2019年1期
关键词:鱼皮酶法胶原蛋白

王锡念,徐志善,孙钦军,包建强,2,3,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海201306;2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306;3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海201306)

鮟鱇鱼(Lophiiformes),又名蛤蟆鱼、结巴鱼等,属于近海底层鱼类,内脏比重大,出肉率低,在加工过程中会产生60%以上的下脚料,鱼皮占下脚料的10%左右[1]。且鱼皮中含有丰富的蛋白质,胶原蛋白占粗蛋白80%左右[2]。胶原蛋白是代表近30%动物体内总蛋白的哺乳动物中最丰富的蛋白[3],主要存在于动物的皮肤、骨、肌腱、韧带及结缔组织等部位中[4-5],与组织间的传递和衰老等有密切的关系[6]。胶原蛋白在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用[7],其不仅可作为保健食品、食品添加剂[7]、美容产品和包装材料,还可制成胶原海绵、胶原膜、胶囊等[8]。所以,如何更好地提取胶原蛋白引起了人们的关注。

超声波辅助酶法常用于提取水产品胶原蛋白,如草鱼皮[9]、鳕鱼皮[10]、鳝鱼皮[11]等,Ye 等[12]在超声辅助提取裙边甲鱼胶原蛋白的研究中,发现超声波提取的胶原蛋白含量和常规方法提取胶原蛋白的含量分别为507.5和436.2 g/kg,比常规方法提取胶原蛋白的含量增加16.3%。目前关于超声波辅助酶法提取胶原蛋白在鮟鱇鱼皮中的应用还未见报道。

因此,本实验选取风味蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行试验,选取酶解胶原蛋白效果较好的两种酶,将超声波分别与风味蛋白酶及碱性蛋白酶结合提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白寻求最优提取方案。以期为解决鮟鱇鱼鱼皮浪费,提供有用的方法及胶原蛋白的工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鮟鱇鱼 舟山兴业有限公司;碱性蛋白酶(200 U/mg)、风味蛋白酶(20000 U/g)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 AR,源叶生物科技有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g)、牛血清 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 均为国产分析纯;实验用水 均为去离子水。

T6新世纪型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;G-060S型歌能牌超声波清洗机 上海鳌珍仪器制造有限公司;FOSS8400型全自动凯氏定氮仪 上海瑞玢国际贸易有限公司;Seven2Go型pH计、ME204型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DK-S28型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;H1850R型高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司;DHG-9070A型鼓风干燥箱 上海鳌珍仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鮟鱇鱼皮的制备 取出于-18℃冷冻的鮟鱇鱼,流水化冻后,将鱼皮剥下,分切成约1 mm×1 mm碎鱼皮块,用10%异丙醇浸泡24 h去除脂肪,用清水冲洗后,用HCl和NaOH调p H至6.5左右,再用10%氯化钠溶液浸泡24 h去除可溶性的非胶原蛋白[13],用清水洗后,放入-50℃的冰箱备用。

1.2.2 鮟鱇鱼皮胶原蛋白的提取 取鮟鱇鱼皮流水解冻1 h,实验用纸将鱼皮外部水分擦干称取,以一定料液比加入一定提取pH的磷酸盐缓冲溶液,分别加入一定量的风味蛋白酶或一定量的碱性蛋白酶,超声一定时间后放入一定温度的恒温水浴锅酶解4 h,最后100℃灭酶10 min,取出冷却,在10000 r/min离心10 min,取上清液测鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率。

1.2.3 酶的筛选 以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标,依照1.2.2,分别采用风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶,控制料液比为1∶15 g/mL,超声时间60 min,提取pH7.5,酶解温度45℃,酶解时间4 h,加酶量4000 U/g进行实验,选出适宜的酶进行接下来的实验。

1.2.4 单因素实验 以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标,采用1.2.3中选出的酶,固定料液比为1∶15 g/mL,超声时间60 min,提取p H7.5,酶解温度45℃,酶解时间4 h,加酶量4000 U/g进行实验。

设定变量因素的水平依次为料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL),超声时间(40、50、60、70、80 min),提取 pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5),酶解温度(35、40、45、50、55 ℃),酶解时间(2、3、4、5、6 h),风味蛋白酶(碱性蛋白酶)添加量(2000、3000、4000、5000、6000 U/g)。实验重复3次,数据取均值。

1.2.5 正交试验 在单因素实验的基础上,用胶原蛋白提取率为判断标准并结合文献[14],选出以下四个因素进行正交试验。以加酶量(风味蛋白酶、碱性蛋白酶)、超声时间、酶解时间和酶解温度为考察因素,各选取3个水平,采用L9(34)实验设计,以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为评价指标,确定最佳提取工艺。实验因素及水平表见表1和表2。

表1 超声-风味酶法提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白因素水平表Table 1 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic flavor enzyme method

表2 超声-碱性酶法提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白因素水平表Table 2 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic alkaline enzyme method

1.2.6 胶原蛋白提取率的测定 鮟鱇鱼皮蛋白质含量的测定[15]采用 GB 5009.5-2016凯氏定氮法。通过测定羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白提取率,羟脯氨酸的测定参照文献[16]。羟脯氨酸标准样品的回归方程:y=0.2244x-0.0006(R2=0.99997)。鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率以干基表示[17]:

式中:X为鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率,%;w为羟脯氨酸含量,g;11.1为羟脯氨酸转为胶原蛋白的系数;m为鮟鱇鱼皮蛋白质含量,g;k为鮟鱇鱼皮水分含量,%。

1.3 数据处理

每组实验重复次数3次,采用Origin 8.5和SPSS 24.0进行数据分析,将数据输入软件中进行计算及分析。

2 结果与分析

2.1 酶种类的选择

从图1可以看出,3种酶提取胶原蛋白提取率的大小顺序为:风味蛋白酶>碱性蛋白酶>胰蛋白酶。不同的酶对肽键的专一性不同,风味蛋白酶具有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性,因此酶切位点会更多,效果更好;碱性蛋白酶和胰蛋白酶都只是内切蛋白酶,碱性蛋白酶的主要酶切位点为Tyr、Phe、Trp;胰蛋白酶以Arg、Lys为C-端的肽键为主要酶切位点[18-19];所以,碱性蛋白酶和胰蛋白酶与风味蛋白酶相比效果较差。根据胶原蛋白提取率的大小,选用风味蛋白酶进行单因素正交试验,对提取工艺进行详细的探讨。

图1 不同酶对胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of different enzymes on the extraction rate of collagen

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对胶原蛋白提取率的影响 由图2可知,超声-风味酶法的胶原蛋白提取率高于超声-碱性酶法。随着料液比的持续增大,超声-风味酶法、超声-碱性酶法提取胶原蛋白提取率呈现“先增大,后降低”的趋势,当料液比在1∶15 g/mL时,胶原蛋白提取率都出现峰值。底物量一定时,当料液比在1∶5~1∶15 g/mL,磷酸缓冲溶液的量逐渐增加,酶与底物逐渐充分结合,使得胶原蛋白提取率升高;继续增加磷酸缓冲液的量至1∶25 g/mL时,对反应体系而言,磷酸缓冲溶液的量过高,酶的浓度降低,其与底物不能达到最佳作用点,造成胶原蛋白提取率提取率下降。因此,选择料液比为1∶15 g/mL。

图2 料液比对胶原蛋白提取率的影响Fig.2 Effects of material and liquid ratio on the extraction rate of collagen

2.1.2 超声时间对胶原蛋白提取率的影响 图3显示,超声-风味酶法的胶原蛋白提取率高于超声-碱性酶法。随着超声时间延长,胶原蛋白提取率呈现先升高后降低的趋势,在超声时间为70 min时,胶原蛋白提取率值达最大值,表明此时超声波作用效果最佳。超声时间超过70 min后,胶原蛋白的提取率下降,推测超声波时间越长,体系的温度会相对升高,这可能会造成胶原蛋白发生部分水解或体系酶的活力被抑制[20]。因此,应注意控制超声时间,选定超声时间为70 min。

图3 超声时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of collagen

2.1.3 蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响 从图4中可以得出,超声-风味酶法提取胶原蛋白的效果优于超声-碱性酶法。风味蛋白酶加酶量为2000~4000 U/g时,胶原蛋白提取率与加酶量成正比;在加酶量超过4000 U/g后,胶原蛋白提取率呈下降趋势;这是因为当酶的浓度相对于底物浓度较高情况下,反应快慢由底物浓度决定,所以继续增加酶用量,胶原蛋白提取率不再增加[21]。因此,从节约成本角度出发,风味蛋白酶选择加酶量为4000 U/g。而碱性蛋白酶加酶量要在5000 U/g时胶原蛋白提取率才最佳。

图4 蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响Fig.4 Effects of protease addition on extraction rate of collagen protein

2.1.4 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响 由图5可知,超声-风味酶法提取胶原蛋白的效果优于超声-碱性酶法。超声-风味酶法,酶解时间2.0~4.0 h时,随着酶解时间的延长,底物与酶充分接触,胶原蛋白提取率增加;酶解时间为4 h时,胶原蛋白提取率最高;在酶解时间4.0 h后胶原蛋白提取率稍有下降,这是因为当酶量一定时,酶解时间越长,部分胶原蛋白发生水解[22]。因此,超声-风味酶法宜选用酶解时间4.0 h。而对于超声-碱性酶法,酶解时间为5.0 h时,胶原蛋白提取率最大,比超声-风味酶法多用1.0 h。

图5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.5 Effects of enzymolysis time on the extraction rate of collagen

2.1.5 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响 由图6可知,酶解温度对胶原蛋白提取率有明显影响,超声-风味酶法提取胶原蛋白的效果优于超声-碱性酶法。对于超声-风味酶法,在35~45℃时胶原蛋白提取率随着温度升高不断增大;在45℃胶原蛋白提取率最高;当温度高于45℃时提取率开始下降,推测温度过高会使胶原蛋白发生部分水解或相关酶活受到了抑制。超声-碱性酶法,温度在35~40℃胶原蛋白提取率呈上升的趋势;在40℃时,胶原蛋白提取率最高;温度40℃后,胶原蛋白提取率呈下降的趋势,因为温度对酶解反应速度具有两面性,酶解温度的上升可使酶解反应速度加快,同时当酶解温度过高时,酶容易变性,使得酶活力下降[23],胶原蛋白提取率下降。

图6 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响Fig.6 Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of collagen

2.1.6 提取pH对胶原蛋白提取率的影响 由图7可知,超声-风味酶法提取胶原蛋白的效果优于超声-碱性酶法。胶原蛋白提取率随提取pH的增大呈现先上升后降低的趋势。超声-风味酶法,p H8.0时胶原蛋白提取率最大;超声-碱性酶法,p H7.5时胶原蛋白提取率最大。p H过大,会使酶的活性降低,超声-风味酶法和超声-碱性酶法分别在p H8.0和p H7.5后胶原蛋白提取率开始降低。

图7 提取pH对胶原蛋白提取率的影响Fig.7 Effects of extraction of pH on the extraction rate of collagen

2.2 正交试验

2.2.1 超声-风味酶法 从表3比较R值的大小可知,影响超声-风味酶法提取胶原蛋白因素的主次顺序依次为:酶解温度(D)>超声时间(B)>风味蛋白酶加酶量(A)>酶解时间(C),由此可见,酶解温度对胶原蛋白的提取率影响最大。其提取条件的最佳组合为A3B1C1D1,即风味蛋白酶5000 U/g,超声时间60 min,酶解时间4 h,酶解温度40℃,在此条件下,胶原蛋白提取率为3.45% ±0.07%;表3的9个实验组中最佳组合为A3B3C2D1,即风味蛋白酶5000 U/g,超声时间80 min,酶解时间5 h,酶解温度40℃,在此条件下,胶原蛋白提取率为3.54% ±0.21%。因此,A3B3C2D1为实验最佳条件组合。表4超声-风味酶法提取胶原蛋白方差分析表可以看出,4种因素中,超声时间对超声-风味酶法提取胶原蛋白提取率的影响差异性显著(p<0.05)。

表3 超声-风味酶法提取胶原蛋白正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic flavor enzymatic extraction of collagen

2.2.2 超声-碱性酶法 从表5比较R值的大小可知,影响超声-碱性酶法提取胶原蛋白因素的主次顺序依次为酶解时间(C)>超声时间(B)>酶解温度(D)>碱性蛋白酶加酶量(A)。其提取条件的最佳组合为A2B3C3D3,即碱性蛋白酶5000 U/g,超声时间80 min,酶解时间6 h,酶解温度45℃,在此条件下,胶原蛋白提取率为2.77% ±0.08%;表5的9个实验组中最佳组合为A1B3C3D3,即碱性蛋白酶4000 U/g,超声时间80 min,酶解时间6 h,酶解温度45℃,在此条件下,胶原蛋白提取率为3.25% ±0.68%,因此,最终选择A1B3C3D3为实验最佳条件组合。由表6超声-碱性酶法提取胶原蛋白方差分析表可以得出,酶解时间差异性显著(p<0.05)。

表5 超声-碱性酶法提取胶原蛋白正交试验结果Table 5 Orthogonal test results of ultrasonic alkaline extraction of collagen protein

表6 超声-碱性酶法提取胶原蛋白方差分析表Table 6 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic alkaline enzyme method

2.3 超声-风味酶法与超声-碱性酶法的比较与分析

从表7可以看出,超声-风味酶法提取胶原蛋白提取率为3.54%±0.21%,超声-碱性酶法提取胶原蛋白提取率为3.25%±0.68%。超声-风味酶法的酶解时间比超声-碱性酶法少1 h,而超声-风味酶法提取胶原蛋白提取率比超声-碱性酶法高0.29%。可以说明超声-风味酶法提取胶原蛋白效果更好。

表7 两种提取方法的结果比较Table 7 Comparison of the results of two extraction methods

表4 超声-风味酶法提取胶原蛋白方差分析表Table 4 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic flavor enzyme method

3 结论

对超声波辅助酶法提取胶原蛋白的工艺进行优化。超声-风味酶法提取胶原蛋白最佳组合为风味蛋白酶5000 U/g,超声时间80 min,酶解时间5 h,酶解温度40℃,在此条件下得到胶原蛋白提取率为3.54%±0.21%。超声-碱性酶法提取胶原蛋白的最佳组合碱性蛋白酶4000 U/g,超声时间80 min,酶解时间6 h,酶解温度45℃,在此条件下得到胶原蛋白提取率为3.25%±0.68%。由此得出,超声时间都为80 min时,超声-风味酶法提取胶原蛋白的酶解时间比超声-碱性酶法少1 h,且提取率还高出0.29%。说明超声-风味酶法提取胶原蛋白的方法更佳。通过这种方法解决了废弃鱼皮的再利用,而且为胶原蛋白生产工业提供较大的实际利用价值,对鮟鱇鱼皮的综合利用具有一定的指导意义。

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