尾巨桉树皮提取物抗氧化活性及其成分分析

石甜甜，李晶晶，* ，林春凤，程 浩，裴梓廷，农福归，甘金佳，毛玲莉

(1.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林541004;2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西桂林541006;3.广西农业科学院桂北分院桂林市农业科学院，广西桂林541006)

桉树属于桃金娘科桉属的一种乔木，是我国重要的造林树种之一，在我国的种植面积很大(仅次于巴西和印度，居世界第3位)，桉树作为人造板和纸浆造纸的优良原料，桉叶和树皮是其加工业的主要副产品，生物量非常大［1－3］。其化学成分研究集中于枝叶，按照挥发性可分为挥发性成分和非挥发性成分两类，已报道的非挥发性成分主要有三萜类、黄酮类、鞣质、酰基间苯三酚类、酚酸类、甾醇类、脂肪酸等［4］。桉叶成分的生物活性研究主要集中在抗氧化和抗菌活性方面［5］。

近年来国内外对桉树树皮中活性成分的研究日益活跃。研究表明，桉树树皮含有单宁［6－7］、三萜类［8－10］、间苯三酚类、黄酮类、单萜类、酚酸类、甾醇类和脂肪酸类活性物质［10－13］，是一种可以重复利用的生物资源。但在中国绝大部分树皮资源尚未得到利用，而是被废弃或焚烧，这不但增加了固体废物处理的环境负担，而且造成了树皮资源的过渡浪费。目前，绝大多数桉树树皮的化学成分还未有研究，已有研究的仅有蓝桉、大桉、直杆蓝桉、窿缘桉和Eucalyptus urograndis等少数几个树种;针对桉树树皮抗氧化活性的研究还不够深入，主要集中于体外抗氧化活性，缺乏动物体内研究及抗氧化作用机制的研究，造成树皮资源开发再利用的理论基础极其缺乏。

尾巨桉(Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis)是广西目前主要种植的桉树树种，目前关于尾巨桉树皮的抗氧化活性和化学成分研究未见报道。本文采用总还原力、DPPH清除能力和Fe2+螯合能力三种体外抗氧化模型以及D－半乳糖致衰老动物模型，对尾巨桉树皮乙醇提取物的抗氧化作用进行研究，并测定其总黄酮、总单宁和总三萜含量，以期为桉树树皮资源的开发再利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

尾巨桉树皮 尾巨桉自然脱落树皮和新鲜树皮均于2016年11月采自广西柳州鹿寨县黄冕林场，由广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所姚月锋副研究员鉴定;实验动物 雌雄各半4周龄SPF级KM(昆明)小鼠50只(体质量18～22 g)，购自于桂林医学院动物实验中心，动物许可证号:SCXK(桂)2013－0001;D－半乳糖 北京索莱宝生物科技有限公司;芦丁、没食子酸、熊果酸标准品 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;SOD、MDA、CAT、GSH－Px和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程中心;其余试剂 均为国产分析纯。

FE－130型植物粉碎机 河北黄骅科学仪器厂;EYELA－1型旋转蒸发仪 日本Tokyo Rikakikai公司;101A－1E型电热恒温鼓风干燥箱 上海实验仪器有限公司;LUX型多功能性酶标仪、Biomate3S型紫外可见光分光光度仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 尾巨桉树皮乙醇提取物的制备 分别称取2 kg尾巨桉自然脱落树皮和新鲜树皮于40℃干燥后粉碎过筛(60目)，将植物粉末置于10 L 95%乙醇中室温下冷浸提取，共提取3次，每次7 d，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩分别得到尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物浸膏和新鲜树皮乙醇提取物浸膏，置于4℃冰箱中保存［14］。实验前取适量浸膏置于蒸发皿内，于60℃鼓风干燥箱中干燥成粉末后粉碎过筛(100目)，用于生物活性与化学成分测定。

1.2.2 体外抗氧化活性测定 准确称取1.2.1中尾巨桉树皮乙醇提取物粉末0.0025 g，置于烧杯中，用无水乙醇溶解后移入100 mL容量瓶中，加入无水乙醇至刻度配成25μg/mL的母液。采用对半稀释法，取25 mL 25μg/mL的溶液移入50 mL容量瓶中，加入无水乙醇至刻度配成12.5μg/mL的溶液。按照上述方法，依次配制 6.25、3.125μg/mL的溶液，得到3.125、6.25、12.5和25μg/mL样品溶液用于体外抗氧化活性测定。

1.2.2.1 总还原能力测定 分别取上述不同浓度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)的样品溶液 0.5 mL，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH6.6 0.2 mol/L)，2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，于50℃水浴中水浴20 min，再分别加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于室温下反应10 min。取其中溶液2.5 mL，并加蒸馏水2.5和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液，混合均匀，10 min后于700 nm波长下测定并记录吸光度值［15］。以相同浓度的VC做阳性对照。

1.2.2.2 DPPH·清除率测定 分别取上述不同浓度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)的样品溶液各 2.0 mL，再加6×10－5mol/L DPPH 2.0 mL溶液充分混匀。室温黑暗放置30 min后，用相应的溶剂(无水乙醇)做参比，在517 nm可见光波长测定吸光值为A样品。同时，待测样品溶液2.0 mL与2.0 mL无水乙醇混合液，在517 nm可见光波长测定吸光值为 A对照。向2.0 mL DPPH溶液中加入2.0 mL无水乙醇，记录吸光值为A空白，作为空白对照［16］。用相同浓度的 VC作阳性对照。

1.2.2.3 亚铁离子螯合能力的测定 分别在0.1 mL上述的不同浓度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)样品溶液中加入0.05 mL FeCl2(2 mmol/L)和0.1 mL菲洛嗪(5 mmol/L)，用无水乙醇将反应体积稀释到3 mL，混合均匀后在室温下放置10 min，于562 nm测定吸光值［17］以相同浓度的VC作阳性对照。样品对菲洛嗪－Fe2+复合物生成的抑制率(%)计算公式如下:

式中，A0为不含待测样品时FeCl2和菲洛嗪混合液的吸光值;A为加入待测样品溶液和FeCl2溶液和菲洛嗪混合液的吸光值。

1.2.3 尾巨桉树皮提取物对D－半乳糖致小鼠衰老的改善作用研究 将适应环境饲养1周后的KM小鼠随机分为5组，即正常组、衰老对照组、尾巨桉树皮提取物低剂量灌胃组、尾巨桉树皮提取物高剂量灌胃组，维生素C灌胃组(阳性对照组)，每组10只，雌、雄鼠各一半。实验开始后，小鼠每日腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)，正常组注射等体积的生理盐水，造模时间为4周，每周称重一次，依据末次称重的克数调整给药剂量。第四周末，分别选取正常组和衰老模型组小鼠(备用)各10只，摘眼球采血，分离血清，测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量，以验证小鼠衰老情况，衰老模型组小鼠指标与正常组相比具有统计学意义，表示造模成功。

第5周开始，正常组除每日继续注射等体积的生理盐水外每日灌胃0.2 mL蒸馏水，衰老对照组除每日腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)外每日灌胃0.2 mL蒸馏水，尾巨桉树皮提取物低剂量灌胃组、尾巨桉树皮提取物高剂量灌胃组和维生素C灌胃组除每日继续腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)外，每日分别灌胃尾巨桉树皮提取物粉末(20和100 mg/kg)及维生素C(100 mg/kg)，持续4周，每周记录小鼠体质量，然后对所有小鼠禁食24 h后，眼球取血，断颈处死后取肝脏和肾脏进行后续实验［18］。

1.2.4 血清、肝脏和肾脏组织中SOD、CAT和GSH－Px酶活性及MDA水平测定 小鼠血浆静置1 h后离心分离(4 ℃，3500 r/min，15 min)，然后取上层血清，按试剂盒说明书测定小鼠血清中的SOD、CAT、GSH－Px活性及MDA水平。分别将小鼠肝脏和肾脏制成10%的匀浆液后(4℃，3500 r/min，15 min)离心，取上清液按试剂盒说明书测定SOD、CAT、GSH－Px和MDA的活性。

1.2.5 尾巨桉树皮黄酮含量的测定 按照参考文献［19］的方法，称取真空干燥(60℃、5 h)至恒重的芦丁标准品20 mg，用无水乙醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，配成200μg/mL的芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 mL 移入比色管中，分别加入无水乙醇至7.5 mL，依次加入0.5 mL(100 g/L)硝酸铝溶液，0.5 mL(9.8 g/L)醋酸钾溶液摇匀，加蒸馏水至16.5 mL，摇匀，静置1 h，以零管为空白，于波长为415 nm测定吸光度。以芦丁含量(μg)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

准确称取尾巨桉树皮的乙醇提取物粉末0.05 g，置于烧杯中，用无水乙醇溶解后移入50 mL容量瓶中，加入无水乙醇至刻度混匀备用。吸取一定浓度(1.0 mg/mL)的待测样品溶液0.5 mL，移入比色管中，重复标准曲线制作步骤，于415 nm测定样品溶液的吸光度值。

式中:W－样品中黄酮的质量分数(%);C－从标准曲线中查得样品测定液中黄酮的含量(μg);V1－样品测定液总体积(mL);m－尾巨桉树皮乙醇提取物的质量(g);V2－测定时所取的样品测定液体积(mL)。

1.2.6 尾巨桉树皮单宁含量的测定 分别吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L 的没食子酸标准使用液各1.0 mL，分别加入5.0 mL蒸馏水，1.0 mL钨酸钠－钼酸钠混合溶液和3.0 mL碳酸钠溶液，混匀，放置2 h，以标准曲线0.0 mg/L为空白，在765 nm波长下测定标准溶液的吸光度，以没食子酸含量(mg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线［7，20］。

吸取1.2.5中配制的1.0 mg/mL的待测样品溶液1.0 mL，按照标准曲线制作步骤，在765 nm波长下测定样品溶液的吸光度，根据标准曲线及公式计算待测样品液单宁含量。

式中:W－样品中单宁质量分数(%);V－容量瓶的体积(mL);C－从标准曲线中查的样品测定液中所含单宁含量(mg);V1－样品测定液的总体积(mL);V2－测定时所取样品测定液的体积(mL);m－尾巨桉树皮乙醇提取物的质量(g)。

1.2.7 尾巨桉树皮三萜含量的测定 分别吸取熊果酸标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相当于熊果酸0～58.5μg)，置于10 mL比色管中，于60℃水浴蒸干，加入0.4 mL 5%香草醛－冰醋酸，混匀，加1.0 mL高氯酸，混匀，在60℃水浴中加热15 min后移入冰浴中冷却，并加入冰醋酸5 mL，混匀后置于室温下，在30 min内，于548 nm处测定并记录吸光度值，以熊果酸质量(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

准确称取树皮的乙醇提取物粉末0.05 g，置于50 mL容量瓶中，加入约30 mL氯仿，置于超声提取器中(1200 W)超声波提取30 min，取出冷却至室温，并加氯仿至刻度，摇匀，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，于60℃水浴蒸干，按照标准曲线制作步骤，在548 nm波长下测定样品溶液的吸光度［21］，根据标准曲线及公式计算待测样品液三萜含量。

式中:W－样品中三萜的质量分数(%);C－从标准曲线中查得样品测定液中总三萜的含量(μg);V1－样品测定液总体积(mL);m－尾巨桉树皮乙醇提取物的质量(g);V2－测定时所取的样品测定液体积(mL)。

1.3 数据处理

每个样品和每只小鼠的血清和组织测定实验进行三次平行实验后取平均值，采用Excel 2010和SPSS 19.0进行数据处理和统计分析。测定结果均以“平均值±标准差”表示。采用one－way ANOVA方法进行差异分析，以p＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 尾巨桉树皮提取物的抗氧化活性分析

2.1.1 尾巨桉树皮提取物的还原能力分析 尾巨桉树皮乙醇提取物的总还原力如图1所示，在所测定的浓度范围内，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提物和尾巨桉新鲜树皮乙醇提取物还原力均随测试浓度的增大而增强。同时，在所有测试浓度下，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提物的还原力都显著(p＜0.05)高于对照药剂维生素C和尾巨桉新鲜树皮乙醇提取物的还原力。

图1 尾巨桉树皮提取物的还原力Fig.1 Reducing power of E.urophylla×E.grandis bark extracts注:同浓度不同小写字母表示差异显著(p＜0.05);图2、图3同。

2.1.2 尾巨桉树皮提取物的DPPH清除能力分析由图2可见，在3.125～25μg/mL范围内，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物清除DPPH·的效果具有明显的剂量－效应关系，且清除效果显著高于对照药剂维生素C(p＜0.05)。在3.125～25μg/mL范围内，尾巨桉新鲜树皮乙醇提取物清除DPPH·的效果具有明显的剂量－效应关系，当浓度达到25μg/mL时，尾巨桉新鲜树皮乙醇提取物对DPPH·的清除率到达91.34%，显著高于同一浓度下尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物的清除率(86.21%)与维生素 C的清除率(71.46%)(p＜0.05)。

图2 尾巨桉树皮提取物的DPPH·清除率Fig.2 Metal scavenging DPPH effects of E.urophylla×E.grandis bark extracts

2.1.3 尾巨桉树皮提取物的Fe2+螯合能力分析 一些金属离子，如铁离子、铜离子在脂质的氧化过程中起催化作用，因此具有金属螯合作用的物质可以间接地起到抗氧化的作用。从图3可以看出，在3.125～25μg/mL范围内，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提物和尾巨桉新鲜树皮乙醇提取物的金属螯合能力均随着浓度的增加而平缓增加，在浓度25μg/mL时，两者对亚铁离子的螯合率均达到最大，分别为28.86%和21.43%，但均低于对照药剂维生素C(30.01%)。由图1～图3可以看出，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物的体外抗氧化活性比新鲜树皮乙醇提取物的活性强，因此，选择尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物进一步测定其对D－半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化作用。

图3 尾巨桉树皮提取物的亚铁离子螯合能力Fig.3 Chelating effects of E.urophylla×E.grandis bark extracts

2.2 尾巨桉自然脱落树皮提取物对小鼠MDA水平与 SOD、CAT、GSH－Px酶活性的影响

2.2.1 树皮提取物对小鼠血清中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px酶活性的影响 由表1可知，与衰老对照组小鼠相比，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物处理组小鼠血清中SOD、CAT及GSH－Px酶活力显著升高(p＜0.05)，而血清中 MDA含量显著降低(p＜0.05)，表明灌胃20和100 mg/kg尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物能够明显改善D－半乳糖致衰老模型小鼠机体的抗氧化能力，同时，能够明显改善D－半乳糖对机体造成的氧化损伤。此外，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物高浓度灌胃组(100 mg/kg)对衰老小鼠血清中SOD、GSH－Px酶活力的提升效果以及对MDA含量的降低效果优于同浓度的维生素C灌胃组(p＜0.05)。

表3 小鼠肾脏中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 3 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in kidney of D－galactose induced aging mice(n=10)

2.2.2 树皮提取物对小鼠肝脏中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px、GSH酶活性的影响 表2中数据显示，与衰老对照组小鼠相比，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物高浓度灌胃组(100 mg/kg)小鼠肝脏中

表1 小鼠血清中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 1 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in blood of D－galactose induced aging mice(n=10)

注:#表示与正常组相比差异显著(p＜0.05);*表示尾巨桉灌胃组与衰老对照组相比差异显著(p＜0.05);▲表示尾巨桉灌胃组与维生素C灌胃组相比差异显著(p＜0.05)，表2、表3同。SOD酶活力显著升高(p＜0.05)，且改善效果优于同浓度下的维生素C灌胃组(p＜0.05)。而与衰老对照组相比，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物对小鼠肝脏中CAT、GSH－Px酶活力虽有一定提高，MDA含量也有一定降低，但均无显著性差异(p＞0.05)。

表2 小鼠肝脏中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 2 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in liver of D－galactose induced aging mice(n=10)

2.2.3 树皮提取物对小鼠肾脏中MDA水平与SOD、CAT、GSH－Px、GSH酶活性的影响 由表3可知，与衰老对照组小鼠相比，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物低浓度处理组(20 mg/kg)小鼠肾脏组织中SOD酶活力显著升高(p＜0.05)，MDA含量显著降低(p＜0.05);尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物高浓度处理组(100 mg/kg)小鼠肾脏中SOD、CAT及GSH－Px酶活力显著升高(p＜0.05)，而 MDA含量显著降低(p＜0.05)，表明灌胃尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物能够明显改善D－半乳糖致衰老模型小鼠肾脏的抗氧化能力，同时明显改善D－半乳糖对机体肾脏组织造成的氧化损伤。此外，尾巨桉高浓度灌胃组对衰老小鼠肾脏中SOD、CAT及GSH－Px酶活力的提升效果优于同浓度的维生素C灌胃组(p＜0.05)。

2.3 尾巨桉树皮中抗氧化物质含量分析

尾巨桉自然脱落树皮和新鲜树皮中总黄酮、总单宁及总三萜含量如图4所示。以芦丁含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线为 Y=0.0015X+0.0019(R2=0.9999);以不同浓度的没食子酸作为参比标准，绘制标准曲线为Y=7.7086X+0.0024(R2=0.9993);通过不同浓度熊果酸标准液的吸光度值，绘制标准曲线为Y=0.0038X+0.0009(R2=0.9998)。经过计算得出尾巨桉自然脱落树皮中总黄酮和总三萜含量均高于新鲜树皮，其黄酮和三萜含量分别为6.41%和11.70%，而尾巨桉新鲜树皮中总单宁含量高于自然脱落树皮，达到6.49%。

图4 尾巨桉树皮中总黄酮、总单宁和总三萜含量Fig.4 Contents of total flavonoids，tannins and triterpenoids of E.urophylla×E.grandis bark

3 结论

本研究通过体外和体内实验来检测尾巨桉树皮乙醇提取物的抗衰老作用。实验结果显示，尾巨桉自然脱落树皮和新鲜树皮乙醇提取物都具有较强的还原力，能清除DPPH·自由基，还具有一定的Fe2+螯合能力。动物实验结果表明，尾巨桉自然脱落树皮乙醇提取物能够提高D－半乳糖致衰老小鼠的SOD活力和降低MDA水平;同时，高剂量(100 mg/L)尾巨桉树皮提取物还能提高衰老小鼠体内血清、肝和肾组织中的CAT和GSH－Px的酶活力。成分分析结果发现，尾巨桉自然脱落树皮和新鲜树皮中均含有黄酮、单宁和三萜类化合物，尤其是单宁和三萜类化合物含量丰富。以上的实验结果证明尾巨桉树皮乙醇提取物具有良好的改善衰老作用，且效果优于同浓度的维生素C;尾巨桉树皮中富含黄酮、单宁和三萜类化合物，其具体的活性成分值得进一步研究探索。本研究的结果将为进一步分离纯化尾巨桉树皮中的抗氧化活性物质，以及为尾巨桉树皮抗衰老药物和功能性食品的开发提供理论依据。