磁感应电场提取松茸多糖工艺优化

孟 嫚，张延杰，杨 哪 ，徐学明

(1.咀香园健康食品(中山)有限公司，广东中山528437;2.江南大学食品学院，江苏无锡214122;3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

多糖类的化合物广泛存在于各类植物原料中，它们通常具有降血压，抗老化及抑制肿瘤细胞生长的特殊功效，因而能够作为一种功能性食品原料并广泛的运用在饮料、乳制品和保健产品［1］。松茸是一种珍贵的可食用类真菌，在我国主要分布在东北及西南地区。松茸香气宜人，菌肉肥厚，味道鲜美深受人们的喜爱［2］。同时，松茸多糖来源于松茸(Tricholoma matsutak)的子实体中，含量较大且气味芬芳，能起到提高免疫力和降低胆固醇的作用，特别是其中的甘露聚糖能有效抑制腹水癌并有益肠道健康，因而具有较高的药用价值及开发前景［3］。

刘刚采用响应面技术对松茸多糖的提取工艺进行了优化，并对水提法的关键参数进行了影响分析，发现在95℃下经历3.5 h，最大可获得12%的多糖提取率［4］。同时，孙培龙利用微波辅助技术对松茸多糖进行了提取，发现于120℃且微波处理10 min，可获得9%的多糖提取率［5］。另一些酶法辅助提取松茸多糖的研究也有广泛报道［6－7］。然而，这些技术都是采用的传统水浴提取法(conventional method)［8］。为了实现多糖类天然产物的高效率提取，近年来对一些非传统方法(non－conventional method)也有大量研究报道，比如超声波辅助提取［9］，欧姆加热提取［10］，微波辅助提取［11］，超临界二氧化碳提取［12］，高压脉冲电场提取［13］。磁感应的电场是利用交变磁场产生交变电场的原理，在没有任何金属电极参与的情况下，对闭合回路中的样品生产电效应(感应电场和感应电流)，以便在较短时间内，完成对植物类原料中天然产物的提取。Jin等［14］首先利用感应原理和试验性的变压器结构对盐渍黄瓜浆体中的感应电压和终端电压进行了测量，发现液态样品中的离子浓度越高则终端电压就越强。Yang等［15］采用多级串联的磁回路作为激励源对流体中的桑叶颗粒进行处理并对多糖得率的变化进行了研究，发现励磁强度和体系电导率的提高有利于提取加工，而多糖得率则和频率呈现负相关关系。由于该电场的激励源来源于磁场而非金属极板，因此可避免传统电场技术在高温提取时，造成的电化学反应，极板腐蚀及金属离子污染［16］。

本研究采用管式反应器并结合磁感应电场来辅助提取松茸中的多糖物质，通过单因素试验分析了松茸多糖在提取过程中，水提温度、时间、固液比、激励电压、频率对其得率的影响，同时对比水提法提取时产物的理化特性差异，期待为松茸多糖的高效利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浓硫酸，95%乙醇，丙酮，乙醚，氯仿，磷酸氢二钠(均为分析纯)，邻苯三酚，Tris试剂，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)(以上试剂均为化学纯) 国药集团化学试剂有限公司;新鲜松茸 市购。

UV－1900双波长紫外－可见分光光度计 普析通用仪器有限责任公司;HH－4恒温水浴锅 常州丹瑞实验仪器设备有限公司;ZT－150型中药材粉碎机 永康市展帆工贸有限公司;DGG－9070A军工小烘箱 上海森信实验仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;RW20机械式搅拌机 德国 IKA公司;PL602 12106450－CN电子天平 广州仪科实验室技术有限公司;RJ－LDL－50A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;Free Zone 6L冻干机 美国Labconco公司;MTC－400磁感应电场反应装备 岐昱实业(上海)有限公司;FE30K电导率计 瑞士梅特勒－托利多集团;FE28台式酸度计 瑞士梅特勒－托利多集团;65120B采用精密阻抗分析仪 英国Wayne Kerr电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 每次称取约1000 g的松茸，并对其子实体进行清洗和除杂，将清洗完的子实体表面水分用纸巾吸干，切片(厚度2 mm)，放进60℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过120目筛，得到松茸子实体粉末。

1.2.2 多糖的提取

1.2.2.1 热水提取 准确称取50 g子实体干粉末，按不同固液比加入蒸馏水，于不同温度水浴进行浸提，期间缓慢搅拌，于一定时间后在4000 r/min下离心20 min，用旋转蒸发仪于50℃时将上清液浓缩到原液的20%，缓慢地加入3倍体积的95%乙醇，再于4℃低温放置 24 h，待棕色絮状粗多糖析出，于4500 r/min离心20 min，收集沉淀物并采用丙酮+乙醚(1∶3)抽滤两次，除去脂肪，30℃ 烘干;再将上述得到的固体样品配制成约1%的溶液，加入其25%体积的Sevage试剂［氯仿∶正丁醇=5∶1(V/V)］，振荡20 min，4000 r/min离心10 min，分液漏斗分离取含有多糖的上清液，重复三次。最终，将得到的上清液放于－40℃的冰箱冻块后再放进冻干机中进行干燥得到多糖粉末［4］。

1.2.2.2 磁感应电场辅助提取 准确称取50 g子实体干粉末，按不同固液比加入蒸馏水，于一定温度下以200 mL/min的流量泵入感应电场反应装备，原理如图1所示，磁路为取向硅钢27QG120，单相O型结构，铁芯柱直径220 mm，铁芯高度685 mm，铁芯宽度580 mm，铁芯窗高335 mm，铁芯窗宽160 mm，样品管道内径4 mm，功率10 k W)，期间施加一定频率的励磁电压，处理一定时间后在4000 r/min下离心20 min，后续操作同1.2.2.1。

图1 磁感应电场辅助提取原理Fig.1 The auxiliary extraction principle by magneto－induced electric field

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 热水提取多糖 分别考察:不同温度(70、80、90、100 ℃)于固液比为1∶30 g/mL 和时间8 min;不同时间(4、8、12、16、20 min)于温度70 ℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于温度 70℃和时间 8 min时的多糖得率。

1.2.3.2 磁感应电场提取多糖 分别考察:不同激励电压(700、800、900、1000、1100 V)于频率 400 Hz，温度70℃，固液比1∶30 g/mL和时间8 min;不同频率(300、400、500、600、700 Hz)于激励电压 800 V，温度70℃，固液比1∶30 g/mL和时间8 min;不同温度(70、80、90、100 ℃)于激励电压 800 V，频率 400 Hz，固液比为1∶30 g/mL和时间8 min;不同时间(4、8、12、16、20 min)于激励电压800 V，频率 400 Hz，温度70℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于激励电压 800 V，频率400 Hz，温度70℃和时间8 min时的多糖得率，从而分析磁感应电场工艺参数对多糖得率的影响规律。

1.2.4 磁感应电场提取多糖的工艺优化 通过单因素实验，将得出的各个较优参数采用正交试验法对其进行优化，建立激励电压、电场频率、温度、固液比、提取时间的5因素4水平正交试验，方案采用L16(45)的设计形式，具体参数选择见表1所示。

表1 L16(45)正交试验设计方案及因素水平表Table 1 Factors and levels of L16(45)orthogonal experimental design

1.2.5 多糖含量测定

1.2.5.1 标准曲线绘制 采用苯酚－硫酸比色法，在490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度C(0、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1)为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制吸光度－葡萄糖浓度的关系曲线，步骤参考陈炼红的方法［17］，得到的标准曲线方程为 A=0.5349C+0.0271，相关系数R2=0.9941。

1.2.5.2 松茸提取液中多糖含量的测定 将提取后经干燥过的多糖用体积分数80%乙醇溶液定容于500 mL容量瓶内，吸取1.0 mL以超纯水补至2.0 mL。分别加入质量分数6%的苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置20 min后于紫外－可见分光光度计490 nm波长处测吸光度。将测定出的吸光度代入葡萄糖标准曲线中便可得到多糖提取液中多糖的含量。按下面公式计算出松茸多糖的得率:

式中:Y为松茸多糖得率，%;M1为松茸粉末样品，mg;M2为依据回归方程计算出的粗多糖质量浓度，mg/mL。

1.2.6 介质理化特性测定 料液p H和电导率分别采用酸度计和电导率计进行测定。

1.2.7 流体阻抗测定 采用精密阻抗分析仪对松茸悬浮液流体阻抗进行测量，将其中的流体阻抗探头进口和出口管路连接入系统中，保证其探头的极板测试距离与系统管道内径一致，测试前分别进行开路(空气)、短路(铜块)和高频(100 Ω 电阻，10、100 pF电容于50 Hz～10 MHz)校正，然后测试样品流体的阻抗［18］。

1.3 数据处理方法

采用SPSS 16.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 激励电压对松茸多糖得率的影响

图2为不同激励电压对松茸多糖得率的影响，激励电压施加于铁芯时，料液体系作为次级回路(或闭合电路)即出现感应电压，作为水相体系的料液负载中同时出现磁感应的电流。可以看出，当激励电压低于1000 V时，多糖得率随激励电压的提升而显著提高(p＜0.05)，1000 V下的多糖得率相对于水提组(0 V)则提高了4.9倍。松茸粉水相悬浮液(1∶30 g/mL)的pH为6.3，同时其电导率为3.4 S/m(表2所示)，内部含有大量的自由离子和带电粒子，料液体系具有一定的导电能力。所有电场加工技术(欧姆加热和高压脉冲电场)，需要反应体系具备一定的传导性(0.1～20 S/m)［19］。电场效应能够有效的通过交变磁场的耦合作用于反应介质。在交变电场影响下，料液的电导率越高则系统的能量效率越大［20］。这是因为介质中的带电溶质越多则电导率越大，其次级回路的料液阻抗就降低，根据焦耳定律，样品的消耗功率就提高。同时，在处理过程中施加的电压会在传导性的料液中引发电流，造成带电溶质的大规模定向迁徙并随即产生热效应，使溶质的传质效率提高［21］，进一步的促进松茸多糖的溶出［22］。当系统中的磁场磁通密度小于磁饱和水平时，随着激励电压的提升，松茸多糖得率也随之增加，但增幅则逐渐减少。比如，激励电压1000 V相对于900 V，900 V相对于800 V，800 V相对于700 V的处理样品则多糖得率分别增加了25.3%、23.0%和22.6%。但当激励电压超过1000 V时，系统中的磁场磁通密度超过磁饱和水平，造成磁场的大幅损耗，进而引起系统的输出功率减弱，所以多糖得率反而降低。因此，单因素提取工艺中的最适激励电压为1000 V。

表2 不同固液比下的料液pH和电导率Table 2 The pH－value and conductivity of the medium with various solid－liquid ratio

图2 激励电压对松茸多糖得率的影响Fig.2 The effect of excitation voltage on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.2 频率对松茸多糖得率的影响

从图3得知，当激励电压频率提高则松茸多糖的得率出现降低的趋势。相对于700 Hz电场频率，400、500、600 Hz时的多糖得率分别提高了55.8%、38.6%和24.8%。根据磁感应原理，随着频率的提高，料液中的感应电压保持不变，但系统中的磁场密度下降，初级线圈的阻抗则会增加，最终造成系统的总磁通量和输出功率降低，导致多糖的提取效率降低。进一步，液态样品中的带电溶质在交变电场力作用下会进行定向性的迁徙即形成感应电流，使得样品颗粒经受低强度和低频的“摩擦”作用。系统将励磁后的磁能转换为电能后施加于料液体系并转换为焦耳热能(inductive heating)［23］。同时，料液中的热损耗也即欧姆热，有利于多糖产物从样品组织的细胞及其间隙中的溶出。不同的导磁材料具有最适的工作频率，即在该工作频率时的系统磁损耗最小，能量输入水平最高，故当前系统的最适频率为400 Hz。

图3 频率对松茸多糖得率的影响Fig.3 The effect of frequency on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.3 温度和时间对松茸多糖得率的影响

从图4a可知，随着提取温度的增高其松茸多糖得率也呈现上升的趋势。磁感应的电场加工同欧姆加热OH(ohmic heating)和中强电场MEF(moderate electric field)技术一样，温度和电场强度是提升反应体系传质效率的主要因素，原理上都是增加了对介质的能量输入进而提高了传质效率［24］。例如，当传导性的溶液插入钝性的金属电极后，料液体系的温度迅速提升，因而其带电溶质的传质效率也会相应提高。该研究中不同提取温度70、80、90、100℃的样品相对于水提组(0 V)，施加激励电压后多糖的得率分别提高了287.4%、232.1%、129.3%和100.1%。因此，从多糖得率的提升效率和能耗综合考虑，最适温度选为80℃。从图4b可知，随着处理时间的延长松茸多糖的得率(电场组和水提组)也显著提高(p＜0.05)，但电场组样品在16 min时的多糖得率趋于稳定即10.33%，同时电场组的输出功率也继续增加。因此，电场组的处理时间在16 min较为适宜。

图4 温度和处理时间对松茸多糖得率的影响Fig.4 The effect of temperature and processing time on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide注:a:温度;b:时间。

2.4 固液比和流体阻抗对松茸多糖得率的影响

从图5a可知，不同固液比下经磁感应电场处理的样品相对于水提组(0 V)，其多糖的得率分别提高了 171.8%(1∶20 g/mL)，313.4%(1∶25 g/mL)，

257.1 %(1∶30 g/mL)和 187.8%(1∶35 g/mL)。同时，随着固液比的提高其松茸多糖得率出现先升高而后下降的趋势，这可能跟样品的流体阻抗有关。流体阻抗水平反映出连续流的样品溶液对特定频率交变电流的阻碍能力，其值越高则料液的传导性就越差，样品中的感应电流就越小，系统能量输入水平就越低。从图5b可知，随着反应体系固液比的增加，其松茸悬浮液流体阻抗先降低后升高，而样品的电导率则先升高后减少(表2所示)，松茸多糖得率呈现先增加后降低的趋势(图5a)。当感应电压不变时，进一步根据欧姆定律可知，其介质的阻抗值越低则流体的传导性就会提高［25］，系统能量效率提升进而导致多糖得率增加，反之亦然［25］。因此，由单因素试验可知电场组的最适固液比为1∶25 g/mL。

图5 固液比对松茸多糖得率和流体阻抗的影响Fig.5 The effect of solid－liquid ratio on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide and its fluid impedance注:a:多糖得率;b:流体阻抗。

2.5 最优工艺及参数影响分析

根据上述单因素实验所得到的因素水平并按表3的实验方案进行提取工艺优化，称取16份松茸粉并根据上述编号条件进行其多糖的磁感应电场提取，随后测量各组样品溶液中的多糖得率，结果如下。

由表3分析可知，各工艺参数对松茸多糖得率的影响主次为:电场频率(B)＞激励电压(A)＞时间(E)＞温度(C)＞固液比(D)。同时，该多糖得率的最优工艺参数组合为 A3B3C4D3E3，即激励电压为1000 V、频率 500 Hz、温度 100 ℃、固液比为1∶30 g/mL、时间16 min。在此工艺条件下，进行3次重复提取试验，则多糖得率达到了14.32% ±1.2%，而在相同固液比(1∶30 g/mL)、提取温度(100℃)和提取时间(16 min)下水提组(0 V)的多糖得率为8.74%±1.3%，故上述优化组相对于水提组的多糖得率提高了47.99%。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Experimental designs and results

3 结论

采用大功率的磁感应电场装备对松茸子实体中的多糖进行了有效提取，结果表明:多糖得率与系统的激励电压和温度呈现正向相关，并随电压频率的增加而减少，同时存在着最佳的提取系统固液比。根据5因素4水平的正交试验结果，得出不同磁感应电场辅助提取参数对松茸多糖得率的影响主次为:电场频率＞激励电压＞时间＞温度＞固液比。磁感应电场辅助松茸多糖的最优工艺参数为激励电压1000 V、电场频率 500 Hz、温度 100℃，固液比1∶30 g/mL，时间16 min，松茸多糖得率为14.32% ±1.2%，比热水提取法提高了47.99%。该技术为植物类原料中的高价值产物的有效提取提供了一种参考方法。