宫颈癌患者血浆miRNA- 214的表达水平及其对宫颈癌细胞的影响

施友文,杨浩然,卫兵,张丽丽

(1.安徽医科大学 妇产科,安徽 合肥 230031;2.中国科学技术大学,安徽 合肥 230031；3.安徽医科大学第二附属医院 妇科,安徽 合肥 230031)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌和结直肠癌[1]。据国外文献[2]报道，宫颈癌死亡人数位居女性癌症死亡总数的第4位。尽管宫颈癌早期检测手段多样，如宫颈脱落细胞学检测、阴道镜活检病理检查等[3]，但其术后复发率偏高，严重威胁女性的生命健康[4]。所以，宫颈癌的早期预防及诊断水平迫切需要进一步提高。

微小核糖核酸(miRNA)是近年来关于宫颈癌的研究热点之一。miRNA是一种内源性、非编码的单链小分子RNA，由19～23个核苷酸组成。成熟的miRNA具有调控靶基因表达的作用，能够抑制靶mRNA的翻译，最后在转录后基因水平调控靶基因的表达[5- 6]。近年来研究[7]发现，与宫颈癌相关的miRNA标记物有多种，包括miRNA- 21、miRNA- 214、miRNA- 155等。MiRNA- 214是较早发现的具有抑制癌基因活性的miRNA[8- 10]，在宫颈癌、结直肠癌等恶性肿瘤中miRNA- 214表达水平下降，并且miRNA- 214的表达与肿瘤的发生发展、疾病的诊断、预后等密切相关。因此，本研究拟采用实时荧光定量PCR方法检测miRNA- 214 在宫颈癌患者血浆中的表达情况，以宫颈癌细胞株SiHa为细胞模型，观察miRNA- 214对宫颈癌细胞的增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响，了解其可能的分子机制，为宫颈癌的诊断和治疗提供新的策略。

1 对象和方法

1.1 研究对象

以2016年1月至2018年1月在中国科学院合肥肿瘤医院确诊的50例新发宫颈癌患者为宫颈癌组，平均年龄为(56.2±14.3)岁，均经过组织病理学确诊；同时选取相同年龄段体检健康者50例(健康对照组)，按照年龄段与观察组进行匹配。本研究排除接受过手术治疗、放疗、化疗等的宫颈癌患者，有严重脏器疾病(如心、肝、肺、脑、肾等器官及血液系统疾病)或其他系统肿瘤病史的患者。本研究符合中国科学院合肥肿瘤医院医学伦理委员会要求，并且患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 采集两组全血标本各5 ml，用EDTA抗凝管收集，然后离心，分离血浆，收集于EP管中，置冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测miRNA- 214的表达 20 μl PCR反应体系为：1 μl特异性miRNA- 214 TaqMan检测探针、2 μl反转录产物、10 μl基因表达MasterMix、7 μl除RNA酶水以及反转录得到的总RNA 5 μl。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，进行40个循环。对照组用0.1% DEPC处理。miRNA- 214的上游引物：5′- TGCGGACAGCAGGCACAGAC- 3′，下游引物：5′- GCAGTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。最后用AB 17500高通量实时荧光定量PCR仪器进行PCR检测，用相对表达值表示miRNA- 214的表达水平。

1.2.3 细胞培养和转染 宫颈癌细胞SiHa由安徽医科大学中心实验室馈赠。SiHa在含10%胎牛血清的培养基中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2饱和湿度。取对数生长期细胞，随机为宫颈癌对照组[转染miRNA- 阴性(即miRNA- NC)]和宫颈癌转染miRNA- 214组(转染miRNA- 214模拟物)。转染操作按说明书进行，转染4 h后更换新鲜的完全培养基，重新转染48 h后进行后续实验。最后，使用CCK- 8试剂盒(购于北京天根生物科技有限公司)，并根据说明书检测两组Siha细胞增殖的情况。

1.2.4 流式细胞术检测miRNA- 214对SiHa细胞周期和细胞凋亡的影响 胰酶消化液消化吸收细胞，70%乙醇固定，4 ℃过夜，弃去上清液，以50 μg·ml-1RNAse A溶液重悬，溶液放置1 h，溴化丙啶染液4 ℃下避光孵育30 min，流式细胞术检测细胞周期。最后进行细胞凋亡的检测，操作严格按照细胞凋亡检测盒说明书进行，检测盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。以上所有实验均重复进行3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 宫颈癌组和健康对照组血浆中的miRNA- 214表达水平

PCR检测检测结果显示，miRNA- 214血浆中的相对表达量宫颈癌组为(0.59±0.09) IU·ml-1,低于健康对照组的(1.08±0.18)IU·ml-1，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miRNA- 214对宫颈癌细胞SiHa增殖的影响

CCK- 8法检测结果显示，与宫颈癌对照组宫颈癌细胞SiHa相比，转染miRNA- 214后的宫颈癌细胞SiHa的生长速度明显减慢，差异有统计学意义(P<0.05)。说明miRNA- 214对宫颈癌细胞SiHa生长有抑制作用。见图1。

图1宫颈癌细胞SiHa转染miRNA-214组及宫颈癌对照组细胞生长速度水平

2.3 miRNA- 214对宫颈癌细胞SiHa周期和细胞凋亡的影响

与对照组相比，宫颈癌细胞SiHa转染miRNA- 214组的细胞在S期细胞比例明显降低，凋亡细胞比例明显升高(P<0.05)，而在G2/M期的细胞明显减少(P<0.05)。结果表明宫颈癌细胞miRNA- 214表达水平的下降可能会加速宫颈癌细胞进入G2或M期，反之，miRNA- 214过表达则能够显著促进宫颈癌细胞的凋亡。见表1。

表1两组宫颈癌细胞周期和细胞凋亡的比较

组 别不同细胞周期的细胞数G1SG2/M凋亡率/%SiHa细胞转染miRNA-214组67.70±3.1424.22±1.076.54±2.375.14±0.37宫颈癌对照组65.49±2.9927.97±1.429.88±1.734.01±0.42t值12.1410.795.573.92P值0.2310.1860.0270.013

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，分子标记物在其早期诊断中的作用一直是临床研究热点[11]。近年来大量学者致力于宫颈癌分子标记物的研究，伴随着研究的不断深入，越来越多宫颈癌相关的分子标记物被发现[12- 13]。冯倩倩等[14]发现，miRNA特别是miRNA- 214在宫颈癌的发生、发展过程中发挥了关键性作用，因此，本研究分析了宫颈癌患者血浆中miRNA- 214表达水平及miRNA- 214对宫颈癌细胞增殖、凋亡过程的影响，旨在进一步阐明miRNA- 214在宫颈癌发生、发展中的作用机制。

本研究发现，与健康对照组比较，宫颈癌患者血浆中miRNA- 214表达水平明显下降，这与Wen等[15]的研究结论一致。Wen等认为，在正常情况下机体内各种miRNA表达量相对稳定；当机体出现肿瘤病变后，肿瘤细胞大量地复制，可能会影响其它miRNA 的表达，从而出现某类型miRNA表达量下降；从另一个角度来说，如果刺激相应类型miRNA的过表达，可能会在一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖。本研究发现，与转染miRNA- 阴性宫颈癌细胞SiHa相比，转染miRNA- 214的宫颈癌细胞SiHa生长速度明显减慢，且S期细胞比例明显降低，凋亡细胞比例明显升高，在G2/M期的细胞也明显减少。说明miRNA- 214可以抑制宫颈癌细胞SiHa进入S期，并且促进其凋亡。Zhang等[16]通过研究miRNA 对卵巢癌细胞增殖、凋亡过程影响的分子机制后认为，miRNA对肿瘤细胞增殖的抑制作用可能是通过竞争核苷酸合成过程中所必需的酶来实现的，因此miRNA的过表达对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。而国外几项关于miRNA对肾癌、膀胱癌及胰腺癌的研究发现；miRNA不仅能够抑制肿瘤细胞的增殖，还能够诱导肿瘤细胞的凋亡[17- 19]。研究者们发现，机体内miRNA的过表达，可使得大量肿瘤细胞停滞于细胞周期G2或M期，肿瘤细胞无法完成正常的细胞分裂，并最终走向凋亡。

综上所述，宫颈癌患者血浆中miRNA- 214表达水平下调，可作为宫颈癌早期诊断分子标志物。miRNA- 214可以抑制SiHa增殖，并促进宫颈癌细胞SiHa凋亡，miRNA- 214可能在宫颈癌的发生、发展中发挥着抑癌作用。