酶解改性对燕麦粉中淀粉含量及消化性的影响

王海林,施源德,谢婉研,陈 盛,项雷文

(福建师范大学福清分校,福建福清 350300)

与其它谷物相比,燕麦具有较均衡的营养成分,可作为蛋白、膳食纤维、淀粉等的良好来源[1]。其中,燕麦淀粉含量在50%～65%之间,包括直链淀粉和支链淀粉两部分[2]。直链淀粉因分子内氢键的相互作用,而使分子链卷曲成螺旋形,无法溶于水,且在货架期内燕麦淀粉老化返生;支链淀粉拥有高度分支结构,能溶于水,不易老化返生,但当支链淀粉老化返生后,也具有不溶性[3]。通过酶解改性可以防止淀粉的老化返生,周素梅等[4]采用α-淀粉酶对燕麦中淀粉进行酶解后,制备所得的燕麦乳饮料,无需添加稳定剂,就能达到相对稳定效果。Englyst等[5]根据淀粉的消化速率又将淀粉分成快速消化淀粉(Rapidly digestible starch,RDS)、慢速消化淀粉(Slowly digestible starch,SDS)及抗性淀粉(Resistant starch,RS)。RDS在体内消化后会使血糖水平快速提升,SDS则能预防糖尿病等疾病[6];RS能够降低血糖水平,还可作为肠道内益生菌的生长底物,促进益生菌菌群生长[7]。

在前人对燕麦改性(如焙烤、酶解等)的研究中,主要集中在改性条件的优化及改性后的应用方面,较少对改性前后淀粉的颗粒形貌、含量、及消化性的直接变化及其产生变化的机理进行探讨。燕麦淀粉的颗粒形貌会影响其加工后的口感,且其直链淀粉和支链淀粉,以及快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉之间比例亦会影响到燕麦粉的加工性能及其营养价值。

因此，本实验采用双波长法对天然燕麦粉、焙烤燕麦粉及酶解燕麦粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量进行测定,并测定其快速消化淀粉、慢速消化淀粉和抗性淀粉含量以评价其消化性,同时采用红外光谱仪和电镜对其结构和颗粒形貌进行分析,并对其产生变化的机理进行初步探讨,以期为燕麦粉的加工改性及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

燕麦粒、酶解燕麦粉(DE值为40) 厦门格兰贝尔生物科技有限公司;直链淀粉标准品(A0512)、支链淀粉标准品(A8515)、猪胰α-淀粉酶(50 U/mg)、淀粉葡萄糖苷酶(120 U/mg) 美国Sigma-Aldrich公司;其它试剂 均为分析级,国药集团;直链淀粉标准溶液(用直链淀粉标准品配制浓度分别为5、10、15、20、25、30 μg/mL的溶液);支链淀粉标准溶液(用支链淀粉标准品配制成浓度分别为20、40、60、80、100、120 μg/mL的溶液)。

FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;BS224S电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;PHS-3C型数显酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司;UV754N紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;DHG-9070A电热鼓风干燥箱 上海精密科学仪器有限公司;H1850R高速冷冻离心机 厦门精艺兴业科技公司;Nicolet 380傅立叶变换红外光谱仪 Thermo Fisher Scientific 公司;SU8010电子显微镜 HITACHI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 燕麦粉的制备 将燕麦粒置于万能粉碎机中，粉碎后过60目筛得到天然燕麦粉;将燕麦粒在150 ℃条件下烘烤10 min后,取出冷却翻面,以免烤焦,重复四次,再置于万能粉碎机中粉碎后过60目筛,得到焙烤燕麦粉,用自封袋封装后置于4 ℃冰箱保存备用;酶解燕麦粉 由厦门格兰贝尔生物科技有限公司提供。

1.2.2 电镜扫描 分别取少量天然燕麦粉、焙烤燕麦粉和酶解燕麦粉样品于双面胶上,镀金后,进行电镜扫描,并拍照。加速电压为10.0 kV。

1.2.3 直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量的测定 直链淀粉、支链淀粉含量测定参考蒋卉[8]和刘轶[9]文献中的方法,略作修改。

1.2.3.1 直链淀粉、直链淀粉标准曲线的绘制 取30 μg/mL直链淀粉和120 μg/mL支链淀粉标准溶液，在波长范围(400～960) nm进行扫描(蒸馏水为空白),确定直链淀粉的测定波长和参比波长分别为λ1和λ2,支链淀粉的测定波长和参比波长分别为λ3和λ4。测定直链淀粉和支链淀粉的标准溶液的吸光度值,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3.2 三种燕麦粉中水分含量及脂肪含量的测定 采用GB 5009.3-2016[10]中的直接干燥法测定天然燕麦粉、焙烤燕麦粉及酶解燕麦粉三种燕麦粉的水分含量,并采用GB 5009.6-2016[11]中的索氏提取法测定这三种燕麦粉的脂肪含量。

1.2.3.3 三种燕麦粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量的测定 将1.2.3.2中索氏提取法测定脂肪含量后得到的三种脱脂燕麦粉样品烘干至恒重,并分别准确称取0.2 g三种脱脂样品于烧杯中,加1 mol/L KOH 10 mL,在80 ℃水浴中溶解,加蒸馏水定容至100 mL,静置25 min。吸取样液5 mL于小烧杯中,分别加入50 mL蒸馏水,并用0.1 mol/L 盐酸调pH至3.5,加入1 mL碘试剂后,定容至100 mL,静置25 min。以蒸馏水为空白,在λ1、λ2、λ3、λ4处测定吸光度,根据标准曲线求出稀释样品液中的直链淀粉和支链淀粉的含量。再按公式(1)、(2)、(3)计算出直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量:

直链淀粉(%)=X1×(1-W1-W2)/(5×m)

式 (1)

支链淀粉(%)=X2×(1-W1-W2)/(5×m)

式(2)

总淀粉(%)=直链淀粉+支链淀粉

式(3)

式中:X1、X2分别表示稀释样品液中直链淀粉和支链淀粉含量,μg/mL;W1、W2分别表示样品中水分含量和脂肪含量,%;5表示吸取样液的体积,mL;m表示称取的干燥至恒重的脱脂样品,g。

1.2.4 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量的测定

1.2.4.1 三种燕麦粉中淀粉的提取 燕麦粉中淀粉的提取参考Mirmoghtadaie[12]的研究,分别将三种燕麦粉与0.02 mol/L NaOH溶液按1∶5的比例混合后,于25 ℃条件下搅拌30 min,1400 r/min离心20 min,取沉淀,用50 mL蒸馏水溶解沉淀后,再用300目筛网进行过滤,所得滤液用1 mol/L HCl中和后,1400 r/min离心20 min,再用适量的蒸馏水将沉淀重复洗三次,最后小心取出底部粗淀粉,40 ℃条件下在干燥箱烘干过夜,于干燥器中保存备用。

1.2.4.2 酶液的制备 混合酶液的制备参考Wang等[13]的研究,制备好混合酶液于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4.3 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量的测定 淀粉样品的消化性参考Englyst[14]和胡丹等[15]的研究。准确称取1.2.4.1中提取的三种燕麦粉的淀粉样品100 mg与10 mL乙酸钠缓冲液于具塞锥形瓶混合后,再加入10 mL蒸馏水,5颗玻璃珠,37 ℃条件下恒温保持10 min,再加入1 mL上述的混合酶液,37 ℃ 220 r/min条件下进行振荡,分别在20、120 min时取出一个样品,沸水浴灭酶10 min,冷却后定容至100 mL,最后用DNS法测定还原糖含量,分别记为G20和G120,再按公式(4)、(5)、(6)计算RDS、SDS及RS含量:

RDS(%)=G20×0.9×TS×100÷M

式(4)

SDS(%)=(G120-G20)×0.9×TS×100÷M

式(5)

RS(%)=TS-(RDS+SDS)

式(6)

式中:G20、G120分别表示酶解20、120 min后释放的葡萄糖含质量,mg;M表示称取的淀粉样品的质量,mg;0.9表示糖转化系数;TS表示燕麦粉中总淀粉含量,%;100表示百分数的转化。

1.2.5 红外光谱分析 分别取适量提取出的三种淀粉样品与溴化钾研磨均匀,进行压片后,在(4000～400) cm-1波数范围内用红外光谱仪进行扫描获得红外光谱。

1.3 数据统计

实验重复三次,对实验数据采用SPSS 17.0软件进行显著性(p<0.05)分析。

2 结果与分析

2.1 颗粒形貌观察

三种燕麦粉样品用电镜扫描,其结果如图1所示。

图1 三种燕麦粉电镜扫描图片Fig.1 SEM photos of three oat flour

由图1可知,三种燕麦粉中的淀粉颗粒大小不一,呈圆形或不规则形状。淀粉颗粒之间粘结在一起,这可能是由于直接用燕麦粉来做电镜扫描,燕麦粉中含有水分、蛋白质等其它成分引起。Ovando-Martinez等[1]在研究热处理对燕麦淀粉理化性质及消化性的影响时,也直接采用了燕麦粉对淀粉颗粒进行电镜观察。三种燕麦粉中较大的淀粉颗粒中都存在一些裂痕和凹陷,这与Hoover等[16]对燕麦淀粉的研究得出的结论类似。与天然燕麦淀粉中大淀粉颗粒相比,经过热处理的焙烤燕麦粉和酶解燕麦粉中大淀粉颗粒表面有更多的凹陷,这是由于在热处理时,淀粉的糊化会破坏其形态特性,Ovando-Martinez等[1]的研究也表明,热处理过程会影响其形态特性。

与天然燕麦粉和焙烤燕麦粉中的淀粉颗粒相比,酶解燕麦粉中的小淀粉颗粒数量较少,这可能是小颗粒淀粉具有较大比表面积,能够增大酶与底物的接触面积,从而更容易被α-淀粉酶分解。Svihus等[17]的综述中也提到，小颗粒淀粉具有更好的酶解性这一点。另外,酶解后的燕麦粉中大的淀粉颗粒不仅有颗粒被损坏现象,表面出现的凹陷程度也不同,这可能是酶解过程酶会对淀粉颗粒产生腐蚀造成的。

2.2 直链淀粉、支链淀粉的标准曲线

以蒸馏水为空白,用分光光度计对30 μg/mL的直链淀粉标准溶液和120 μg/mL的支链淀粉标准溶液在400～960 nm范围内进行扫描,结果如图2。根据双波长法的测定原理,确定直链淀粉的测定波长及参比波长分别为λ1=594 nm和λ2=457 nm,支链淀粉的测定波长和参比波长分别为λ3=545 nm和λ4=757 nm。

图2 直链淀粉和支链淀粉扫描图谱Fig.2 The scanning map of amylase and amylopectin

用直链淀粉标准溶液在594、457 nm处测定吸光度,以直链淀粉浓度为横坐标,以ΔA=Aλ1-Aλ2为纵坐标确定直链淀粉标准曲线,如图3所示。其标准曲线回归方程为Y=0.0175X-0.0489,相关系数r=0.9998。

图3 直链淀粉标准曲线Fig.3 Standard curve of amylase

用支链淀粉标准溶液在545、757 nm处测定吸光度,以支链淀粉浓度为横坐标,以ΔA=Aλ3-Aλ4为纵坐标确定支链淀粉标准曲线,如图4所示。其标准曲线回归方程为Y=0.0034X+0.0016,相关系数r=0.9997。

图4 支链淀粉标准曲线Fig.4 Standard curve of amylopectin

2.3 直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的含量

用分光光度计在757、594、545及457 nm四个波长处测定三个样品的吸光度,再根据公式计算出三种燕麦粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量,结果见表1。

表1 燕麦粉样品中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量Table 1 The content of amylose,amylopectin and total starch in the different oat flour

由表1可知,天然燕麦粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量分别为16.66%±0.53%、38.30%±0.98%、54.95%±1.51%。与天然燕麦粉相比,焙烤燕麦粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量均没有显著差异(p>0.05),分别为16.47%±0.59%、36.95%±0.59%、53.42%±1.18%。而酶解改性燕麦粉,其直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量均极显著降低(p<0.01),分别下降了77.97%、43.55%、46.19%。

酶解过程中,α-淀粉酶能够作用于淀粉的α-1,4糖苷键,将淀粉分解成小分子糖,从而降低直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量,这有利于防止淀粉老化返生。汪丽萍等[18]研究也表明,α-淀粉酶能够无差别的作用于燕麦浆中的直链淀粉和支链淀粉的α-1,4糖苷键,将其分解成小分子糊精或糖,且分解产物中含有较多麦芽低聚糖,在液态食品中可利用其粘度而起到增稠稳定作用。采用α-淀粉酶对淀粉进行适当的水解能解决淀粉老化返生,提高液态食品稳定性,并改善其品质[19-20]。

燕麦粉中淀粉、蛋白和葡聚糖缠绕在一起。α-淀粉酶作用后,淀粉粒中淀粉被水解,淀粉粒崩溃,从而使蛋白质得到伸展,一些疏水性氨基酸会暴露,从而造成燕麦产品苦涩味。但同时燕麦粉经α-淀粉酶水解后,其分解产物中包含的β-环状糊精能够对苦味物质具有包埋作用,从而抑制苦味形成。胡勤玲等[21]研究表明,添加10%β-环状糊精于大米蛋白水解液进行包埋30 min后,能够达到基本脱除苦味的效果。叶发银等[22]研究表明,经中温α-淀粉酶改性后的甜菊糖,所制备的产品，其苦味得到明显的改善,甜度和口感均优于原料。

2.4 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉的含量

三种燕麦粉中快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量见表2。由表2可知,天然燕麦粉中RDS、SDS和RS含量分别为18.75%±1.24%、8.99%±1.68%、27.21%±1.19%。与天然燕麦粉相比,焙烤燕麦粉中RDS、SDS和RS含量没有显著差异(p>0.05),分别为18.70%±1.71%、7.73%±0.58%、26.99%±2.28%。而改性燕麦粉中RDS、SDS和RS含量均极显著降低(p<0.01),分别下降了82.29%、57.06%、33.48%。

表2 燕麦粉样品中RDS、SDS和RS含量Table 2 The content of RDS,SDS and RS in the different oat flour

淀粉的消化速率是决定人体内血糖反应重要因素[23]。Araya等[24]研究表明,食用快速消化淀粉含量高的食品,会使血糖水平快速提升,且与糖尿病、冠状动脉性心脏病等疾病的发生有关。酶解改性燕麦粉中RDS含量由原来的18.75%降至3.32%,说明酶解过程极显著降低了燕麦粉中RDS含量(p<0.01),这有利于维持人体血糖稳定。

改性燕麦粉中SDS含量也由原来的8.99%降到3.86%。SDS含量的降低可能与酶解改性过程对淀粉含量及结构产生的影响有关。燕麦粉经α-淀粉酶作用后,总淀粉含量极显著降低(p<0.01),且燕麦粉中淀粉链结构的平均长度和分支密度也会发生相应的改变。于国萍等[25]在采用酶法改性制备慢消化淀粉的研究中,发现SDS含量变化与酶解温度、α-淀粉酶用量、酶解时间及pH有关,在一定范围内,SDS含量随酶解温度、α-淀粉酶用量、酶解时间及pH的增大而增大,但是当超过最适环境时,SDS含量反而会降低,说明了改性过程酶解条件会影响SDS含量的变化,故在改性时探索最佳酶解条件,有利于燕麦粉的改性加工及应用。Ao等[26]和熊姗姗等[27]研究均表明,SDS含量的变化与淀粉链结构平均长度和分支密度密切相关,但是过高或过低的分支密度都有可能会使SDS含量降低。

改性燕麦粉RS含量由原来27.21%降到18.10%。RS结构与RDS的结构有着本质上的区别,但是和SDS有类似的结构[28],因此 RS含量的降低可能也和酶解条件及酶解对淀粉含量及链长结构与分支密度的影响有一定的关系。高群玉等[29]在双酶协同制备玉米慢消化淀粉及其性质研究中表明,随着β-淀粉酶添加量的增多,所有样品的RS含量都不断的降低。另外Serpil等[30]在制备抗性淀粉的研究中也发现,直链淀粉含量高及链越长的玉米淀粉更有利于形成RS。

2.5 红外光谱分析

三种燕麦粉淀粉的红外光谱如图5所示。由图5可知,三种燕麦淀粉均分别在3400、2900 cm-1附近出现O-H键和C-H键的特征吸收峰。在1640 cm-1附近出现由淀粉中水分子的O-H键伸缩振动引起的特征吸收峰。在1200～1000 cm-1之间三种燕麦淀粉也均出现由C-O键的伸缩振动所引起的三个特征吸收峰,其中1200 cm-1附近的吸收峰则是C-O键和C-C键的伸缩振动,而1100、1000 cm-1附近出现的吸收峰分别是C-H键和C-O-H键的弯曲振动[13,31]。因此与天然燕麦淀粉的红外光谱相比,经焙烤和酶解改性后的燕麦粉中淀粉的红外光谱未出现明显差异。

图5 三种燕麦粉淀粉的红外光谱图Fig.5 FTIR spectroscopy of three oat starches

傅立叶变换红外光谱中1047、1022和995 cm-1的吸收强度容易受到淀粉结构变化的影响,其中1047、1022 cm-1吸收强度还分别与淀粉序列和非晶结构有关,1047/1022 cm-1的吸收强度比值可以用来作为淀粉中双螺旋短序列量的指标[32]。此外,与淀粉结构的其它指标相比,1047/1022 cm-1和1022/995 cm-1的吸收强度比值是一个更为实用的指标[33]。三种燕麦淀粉的特征吸收比值见表3。

表3 三种燕麦淀粉的特征吸收比值Table 3 The characteristic absorbance ratio of three oat starches

由表3可知,与天然燕麦粉淀粉相比,经焙烤和酶解改性后的燕麦淀粉在1047/1022 cm-1的吸收比值和1022/995 cm-1的吸收比值没有显著差异(p>0.05),这表明焙烤和酶解改性后淀粉的结构没有发生显著变化。

3 结论

与天然燕麦粉相比,酶解燕麦粉的直链淀粉和支链淀粉含量均极显著(p<0.01)降低,这能够解决传统燕麦在液态食品中应用时产生的淀粉老化返生等问题;且在酶解过程中,燕麦粉中淀粉、蛋白和葡聚糖聚集体崩溃,从而使β-葡聚糖、蛋白质得到伸展,更有利于酶解改性淀粉在溶液中分散。在体外消化模拟中,酶解燕麦粉中RDS、SDS和RS含量均极显著(p<0.01)低于天然燕麦粉,RDS含量的降低有利于维持血糖稳态。酶解改性后的淀粉中含有的小颗粒较少,且表面凹陷程度不同,将会一定程度上影响燕麦粉加工后的口感。