敲低膜联蛋白A5对人胃癌细胞Galectin-3表达的影响*

赵依纳，王小杰，吴雪艳，代雅蕊，张佳璐，李 欣

（承德医学院基础医学院，河北承德 067000）

胃癌是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率分别为42.6%和45.0%，位居所有肿瘤前列，严重威胁着人类健康[1]。膜联蛋白属于钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，膜联蛋白A5（ANXA5）是膜联蛋白家族中分布最广泛、含量最丰富的成员之一。由于ANXA5的促瘤和抑瘤双重调控作用及与磷脂酰丝氨酸极强的亲和力等多种生物学特性，许多学者已将ANXA5作为分子靶点，从多种角度探索了其在肿瘤发生发展与治疗方面的作用[2-4]。研究发现，ANXA5可通过调控上皮间质转化影响胃癌的发生发展[5]，本课题组前期研究亦证实ANXA5具有抑制胃癌细胞增殖的作用，但具体机制尚不明确[6]。半乳糖凝集素3（Galectin-3，Gal-3）是一种多功能β-半乳糖苷结合凝集素，具有抗肿瘤细胞凋亡的作用[7]。研究发现，Gal-3在胃癌组织中显著高表达，且在胃癌的发生、发展、侵袭、转移等方面发挥重要作用[8]。本研究拟观察抑制ANXA5表达后人胃癌细胞Gal-3的表达情况，探讨ANXA5抑制胃癌细胞增殖的机制是否与Gal-3相关，旨在为胃癌发生发展的研究提供新的实验依据，同时为ANXA5作为肿瘤的治疗分子靶点提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 人胃癌HGC-27细胞和MGC-803细胞，购自上海中国科学院细胞库。DMEM培养基为美国Gibco公司产品；无支原体胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒，北京索莱宝生物科技公司产品；转染试剂Lipofectamine2000、靶向ANXA5的siRNA及Trizol，美国Invitrogen公司产品；5×Loading Buffer，购自上海贝博公司。ANXA5、Gal-3兔抗人单克隆抗体，均购自美国Epitomics公司；羊抗兔二抗为美国KPL公司产品；TakaRa反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司。

CO2培养箱，德国贺利公司，型号HER Aceu150；PCR仪，美国MJ公司；紫外分光光度计，美国Thermo公司；Tanon 6100化学发光仪，上海天能公司。

1.2 细胞培养及分组 HGC-27细胞和MGC-803细胞均培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，5%CO2、37℃培养箱中培养。细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组，其中干扰组细胞转染靶向ANXA5的siRNA，阴性对照组细胞转染非特异性siRNA，空白对照组细胞常规条件下培养。

靶向AnnexinA5 siRNA转染细胞：转染前1天将细胞按(4～5)×104个/孔种植于6孔板中，使细胞在24h内达到40%～70%的密度。在无血清DMEM培养基中加入30pmol/L的siRNA Oligo，使终体积为250μl，轻柔混匀；在无血清DMEM培养基中加入5μl Lipofectamine2000，使终体积为250μl，轻柔混匀，室温放置5min；将靶向ANXA5的siRNA Oligo及阴性对照siRNA Oligo分别和Lipofectamine2000转染试剂混合，室温放置20min；将混合物均匀加至培养孔中。转染后6h更换含血清培养基，继续培养48h。

1.3 Western blotting法检测ANXA5和Gal-3蛋白的表达 收集各实验组细胞，每孔加入120μl RIPA细胞裂解液，充分裂解后提取总蛋白；BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，与样品处理液混合后煮沸10min。每样品孔加样30μg，12% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，ANXA5一抗(1：1000)、Gal-3一抗(1：5000)4℃孵育过夜，羊抗兔二抗(1：5000)室温孵育1.5h，ECL发光法液显影。应用Quantity One-v 4.6.2软件分析显影条带，以目的条带与β-actin条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.4 qRT- PCR法检测ANXA5和Gal-3 mRNA的表达 收集各实验组细胞，每孔加入1ml Trizol，提取细胞总RNA后反转为cDNA。以β-actin为内参，检测各组细胞ANXA5、Gal-3 mRNA的表达水平。β-actin上游引物5‘TGGCA CCCAGCACAATGAA3’，下游引物5‘CTAAGTCATAGT CCGCCTAGAAGCA3’，扩增的基因片段为186bp；ANXA5的上游引物5‘CTGACTTCCCTGGATTTG 3’，下游引物5‘TGAAGGAGAACCACCAAC-3’，扩增的基因片段为121bp；Gal-3的上游引物5‘TAACCCACGCTTCAA TGAGAACAA3’，下游引物5‘ACAAGTGAGCATCA TTCACTGCAAC 3’，扩增的基因片段为179bp。qRT- PCR反应体系20μl：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ 0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O 6μl。反应条件：预变性95℃ 30s，PCR反应95℃ 5s，60℃ 20s，共40个循环。反应结束后Setup MxPro vl 4.10 系统自动给出Ct值，按照2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.5 统计分析 实验数据以均值±标准差（±s）表示，应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种胃癌细胞ANXA5蛋白和mRNA的表达情况 与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA干扰组HGC-27和MGC-803胃癌细胞ANXA5蛋白和mRNA的表达水平均明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1：

图1 Western blotting法检测胃癌细胞ANXA5蛋白的表达

表1 两种胃癌细胞ANXA5蛋白和mRNA的表达情况（±s ，n=3）

表1 两种胃癌细胞ANXA5蛋白和mRNA的表达情况（±s ，n=3）

与阴性对照组相比：*P＜0.05；与空白对照组相比：#P＜0.05

细胞系 组别 ANXA5 mRNA ANXA5蛋白HGC-27 siRNA干扰组 0.373±0.073*# 0.038±0.029*#阴性对照组 1.065±0.093 1.209±0.035空白对照组 1.051±0.072 1.279±0.043 MGC-803 siRNA干扰组 0.123±0.087*# 0.064±0.026*#阴性对照组 1.020±0.028 1.095±0.043空白对照组 1.040±0.057 1.027±0.118

2.2 两种胃癌细胞Gal-3蛋白和mRNA的表达情况HGC-27细胞：与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA干扰组细胞Gal-3蛋白和mRNA的表达均明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。MGC-803细胞：siRNA干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞Gal-3蛋白和mRNA的表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2：

图2 Western blotting法检测胃癌细胞Gal-3蛋白的表达

表2 两种胃癌细胞Gal-3蛋白和mRNA的表达情况（±s ，n=3）

表2 两种胃癌细胞Gal-3蛋白和mRNA的表达情况（±s ，n=3）

与阴性对照组相比：*P＜0.05；与空白对照组相比：#P＜0.05

细胞系 组别 Gal-3 mRNA Gal-3蛋白HGC-27 siRNA干扰组 1.831±0.069*# 0.712±0.040*#阴性对照组 0.246±0.049 0.565±0.045空白对照组 0.264±0.048 0.582±0.049 MGC-803 siRNA干扰组 1.124±0.063 1.19±0.057阴性对照组 1.079±0.058 1.225±0.036空白对照组 1.138±0.060 1.225±0.051

3 讨论

膜联蛋白A5（ANXA5）是膜联蛋白家族成员之一，由保守的C端和特异的N末端构成，具有膜融合、离子通道、信号转导等作用。近年来研究证实，ANXA5是一个重要的肿瘤标志物，不仅在多种肿瘤组织中异常表达，还与肿瘤的分化有关。ANXA5在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌中显著高表达[9-11]，在肺癌中则低表达[12]。Liu等[13]采用RNA干扰技术发现，抑制ANXA5在喉癌Hep-2细胞中的表达可促进喉癌Hep-2细胞凋亡，表明ANXA5具有抑制喉癌凋亡的作用；Wehder等[14]通过RNA干扰技术下调ANXA5在口腔癌A431细胞中的表达，细胞的增殖速率显著下降，说明ANXA5能够促进口腔癌细胞增殖。而Gong等[15]的研究表明，上调ANXA5可使细胞周期的G1/S期停滞，从而抑制肺癌细胞的增殖。以上结果表明ANXA5的作用具有组织特异性。

半乳糖凝集素家族是一类含β-半乳糖苷残基的多聚糖且具有很高亲和力的内源性凝集素家族，其家族成员半乳糖凝集素3（Gal-3）在正常组织和肿瘤组织中广泛表达，具有调节细胞生长和抗细胞凋亡的作用。研究证实，Gal-3作为促癌基因在胃癌组织和细胞中均显著高表达，且与胃癌组织的分化及浸润等具有相关性，Gal-3高表达的胃癌细胞，增殖和侵袭能力也明显增强[16]。

课题组前期研究证实，ANXA5具有抑制胃癌细胞增殖的作用，在胃癌中发挥抑癌基因的属性[6]。因此，为探讨ANXA5抑制胃癌细胞增殖是否与Gal-3相关，本研究采用RNA干扰技术抑制胃癌HGC-27细胞ANXA5的表达后，发现Gal-3在mRNA和蛋白水平的表达均显著上调，说明ANXA5对Gal-3的表达具有调控作用，因此，ANXA5抑制胃癌细胞增殖的机制可能与Gal-3有关。由于Gal-3具有抗细胞凋亡的作用[7]，那么ANXA5是否通过调控Gal-3的抗凋亡作用来实现其抑制胃癌的增殖作用，课题组将会进行下一步的深入研究。本研究同时发现，ANXA5低表达的MGC-803细胞Gal-3的表达并未发生明显改变，HGC-27是胃癌未分化细胞，而MGC-803细胞是胃癌低分化细胞，因此猜测出现该结果可能与细胞的分化程度有关，但有待进一步的组织学和细胞学实验进行验证。