甘草微型饮片切制工艺及UPLC 指纹图谱

任晓航， 岳英男， 魏晓峰， 李祥溦， 刘博男， 史 辑，，∗

（1. 辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连116600； 2. 国家中医药管理局炮制原理解析重点实验室， 辽宁大连116600； 3. 辽宁省中药炮制工程技术研究中心， 辽宁 大连116600）

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、 胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat 或光果甘草Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根及根茎［1］， 其味甘、性平， 具有补脾益肺、 清热解毒、 祛痰止咳、 缓急止痛、 调和诸药等功效， 在多个传统经典方剂中起着调和诸药、 缓和药性等作用。 现代药理研究表明， 甘草具有抗溃疡、 解痉、 抗菌、 抗炎、 调血脂、 镇痛、 雌性激素样等作用［2-3］， 其主要化学成分包括三萜、 黄酮、 香豆素、 多糖等［4-5］， 在我国主要分布于内蒙古、 新疆、 甘肃、 黑龙江等地［6-7］。

中药饮片是中药材经过炮制后能直接用于中医临床和中成药生产的处方药， 是国家基本药物； 中药炮制是按照中医药理论对中药材进行各种加工处理的技术， 也是一项传统的制药技术， 最早的饮片称为“口父咀”。 中药饮片是中医临床辨证施治、 复方配伍的基本物质， 也是中医临床灵活用药的独特产品， 能适应中医临床一病一方的特点， 但随着现代生活节奏加快， 采用传统秤称手抓的调剂方式速度慢， 精准度不够， 煎出率低， 劳动强度大， 影响了临床应用。 贾天柱教授首次提出“微型饮片”概念［8］， 其直径在0.5～1.0 cm 左右， 具有流动性好、 煎出率高的特点。

本实验将甘草传统饮片形式进一步加工成微型饮片， 以其流动性、 干膏率、 主要化学成分含有量为评价指标， 通过正交试验对其切制工艺进行优化。 同时， 建立甘草微型饮片UPLC 指纹图谱［9］，并应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对10 批微型饮片进行相似度评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ACQUITY H-class 色谱仪 （美国Waters 公司）； 细集料流动时间测定仪（绍兴市上虞越达仪器厂）； FA1004 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）； AE240 型电子分析天平（十万分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-250E 型医用超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）； 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 材料 甘草酸对照品（批号D0708AS， 含有量＞98%）、 甘草苷对照品（批号J1016AS， 含有量＞98%）、 甘草次酸对照品（批号N1110AS， 含有量＞98%）、 甘草查尔酮对照品（批号S0716AS，含有量＞98%）、 甘草素对照品（批号N0324AS，含有量＞98%）、 异甘草素对照品（批号J1009AS，含有量＞98%） 均由大连美仑生物技术有限公司提供。 甲醇、 乙腈、 磷酸均为色谱纯； 其他试剂均为分析纯； 水为超纯水。

收集了10 批不同来源的甘草， 经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为正品， 具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 含有量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取甘草酸、 甘草苷、 甘草素、 甘草查尔酮、 异甘草素、 甘草次酸对照品适量， 置10 mL 量瓶中， 甲醇定容， 即得。 其中， 各对 照 品 质 量 浓 度 分 别 为0.574、 0.68、0.278、 0.383、 0.238、 0.433 mg／mL。

2.1.2 饮片切制 取甘草（统货） 适量， 采用泡润法进行软化， 切制成斜片， 50 ℃下干燥。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取样品5 g， 置250 mL 具塞锥形瓶中， 精密加入70%乙醇100 mL，密塞， 称定质量， 超声（250 W、 40 kHz） 30 min，放冷， 70%乙醇补足减失的质量， 摇匀， 过滤， 取续滤液， 即得。

2.1.4 色谱条件 BEH C18色谱柱 （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸， 梯度洗脱（0 min， 10%A； 0 ～4.5 min， 32%A； 4.5 ～10 min， 70%A； 10 ～16 min， 95%A； 16 ～18 min，10%A）； 体积流量0.3 mL／min； 柱温25 ℃； 检测波长为237 nm； 进样量1 μL。 色谱图见图1。

2.1.5 线性关系考察 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下进样， 以进样量为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 结果见表2， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下连续进样6 次， 每次1 μL， 测得6 种成分峰面积RSD 分别为0.56%、0.78%、 0.69%、 1.59%、 1.57%、 1.59%， 表 明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、12、 24 h 进样， 测得6 种成分峰面积RSD 分别为1.05%、 1.46%、 1.77%、 1.91%、 1.07%、0.58%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取同一样品6 份， 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.4”项色谱条件下进样， 测得6 种成分峰面积RSD 分别为1.48%、 1.29%、 1.59%、 1.23%、 0.98%、1.20%， 表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 称取含有量已知的微型饮片6 份， 精密称定， 每份约1.0 g， 精密加入等量对照品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下进样分析。结果， 各成分平均加样回收率分别为101.8%（RSD ＝1.5%）、 100.2%（RSD ＝0.89%）、 101.3%（RSD ＝0.68%）、 98.6% （RSD ＝1.9%）、 102.5%（RSD＝1.1%）、 99.4（RSD＝0.29%）。

2.1.10 样品含有量测定 供试品溶液在“2.1.4” 项色谱条件下计算6 种成分综合含有量，公式为综合含有量＝0.3 （A／Amax＋B／Bmax） ＋0.1（C／Cmax＋D／Dmax＋E／Emax＋F／Fmax） （A、 B、 C、 D、E、 F 分别为甘草酸、 甘草苷、 甘草素、 异甘草素、甘草查耳酮、 甘草次酸）。

2.2 干膏率测定 精密称取样品10 g， 置于250 mL圆底烧瓶中， 15 倍量水回流提取3 次， 每次1.5 h， 浓缩， 合并， 置干燥至恒定质量的蒸发皿中， 水浴蒸干， 105 ℃下干燥5 h， 于干燥器内放冷后， 迅速精密称定， 得样品干膏率。

2.3 饮片流动性测定 取微型饮片10 g， 放入细集料流动时间测定仪中测定流动时间， 重复10 次，取平均值。

2.4 切制工艺优化

2.4.1 试验方法 根据预实验， 选取饮片粒径（A）、 厚度（B）、 软化时间（C）、 干燥温度（D）4 个因素， 每个因素3 个水平， 采用L9（34）正交表安排试验， 因素水平见表3。 再计算综合评分， 公式为综合评分＝0.4X／Xmax＋0.4Y／Ymax＋0.2Z／Zmax（X 为有效成分综合含有量， Y 为干膏率， Z 为流动时间）， 结果见表4～5。

表3 因素水平Tab.3 Fators and levels

表4 试验设计与结果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.4.2 结果分析 由表5 可知， 在切制工艺中饮片厚度具有显著影响（P＜0.05）。 确定最佳工艺为A1B1C1D1， 即饮片粒径0.5 ～0.9 mm， 厚度1 mm，软化时间1 h， 干燥温度50 ℃。

2.5 UPLC 指纹图谱建立

2.5.1 色谱条件 同“2.1.4” 项。

2.5.2 供试品溶液制备 同“2.1.3” 项。

2.5.3 精密度试验 取同一供试品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下连续测定6 次， 测得各主要色谱峰的保留时间和峰面积RSD 均小于3%， 表明该方法精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.1.4” 项色谱条件下测定， 测得各主要色谱峰的保留时间和峰面积RSD 均小于3%， 表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批饮片6 份， 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.4”项色谱条件下测定， 测得各主要色谱峰的保留时间和峰面积RSD 均小于3%， 表明该方法重复性良好。

2.5.6 相似度测定 取10 批供试品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下测定， 将所得指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A），对色谱峰进行多点校正并自动匹配， 生成UPLC 指纹图谱， 见图2， 计算相似度， 见表6， 有25 个共有指纹色谱峰， 由于每个样品的非共有峰峰面积均小于总面积的10%， 因此符合指纹图谱要求。 另外， 10 批微型饮片与对照指纹图谱的相似度均＞0.9， 具有较好的一致性， 表明切制方法及规格可行， 质量可控。

图2 10 批样品UPLC 指纹图谱Fig.2 UPLC fingerprints of ten batches of samples

3 讨论

3.1 样品来源 对收集得到的甘草进行含有量测定， 发现甘草苷、 甘草酸均符合2015 年版《中国药典》 相关规定（分别不得少于0.50%、 2.0%）。

表6 10 批样品相似度Tab.6 Similarities of ten batches of samples

3.2 样品前处理 切制是中药材炮制为饮片的关键环节， 《五十二病方》 中载有“细切” “削”“剡” 等， 都指的是切制， 目的是便于饮片有效成分的煎出， 有利于进一步炮制和制剂。 甘草纤维性强， 组织致密， 切制成粒径较小的微型饮片亦不易破碎， 且软化及干燥过程中有效成分不易流失。

采用单因素试验考察甘草不同饮片类型中有效成分的含有量， 发现微型饮片明显高于甘草斜片及圆片（圆片内径约2 cm； 斜片长轴约5 cm， 短轴约2 cm）， 而甘草粉末虽然溶出率稍高， 但在煎煮过程中会出现糊锅现象， 且不易过滤， 杂质过多［10-12］， 因此将正交设计中的直径控制在0.5 ～2.0 cm 之间。 同时， 对饮片切制前的软化方法进行了单因素试验考察， 发现泡润法软化在工艺操作和有效成分含有量方面都优于淋润法、 蒸制法软化。 根据润制过程中是否能保证片形完整性， 本实验以软化1、 2、 3 h 作为控制水平。

3.3 色谱条件选择 甘草成分比较复杂， 主要有三萜皂苷（甘草酸、 甘草次酸）、 黄酮（甘草苷、异甘草苷）、 甘草多糖等。 2015 版《中国药典》 中甘草的质量控制只以甘草酸、 甘草苷作为含有量测定指标， 不能系统完整地反映药材内在质量。 本实验采用UPLC 法同时测定甘草中6 种成分的含有量来评价工艺参数， 参考HPLC 条件， 采用C18反相色谱柱， 0.1%磷酸-乙腈梯度洗脱［13-15］， 同时考察了0.3、 0.6 mL／min 体积流量， 发现0.3 mL／min下各色谱峰出峰时间较好， 同时10% ～95%乙腈梯度洗脱也保证了色谱峰分离效果适中。

3.4 指纹图谱建立 本实验所建立的甘草微型饮片UPLC 指纹图谱［16-17］中确定了25 个共有峰， 对其进行归属分析后指认了甘草苷、 甘草酸、 甘草素、 甘草次酸、 异甘草素、 查耳酮。 同时， 它与传统饮片指纹图谱对比没有明显差异。

3.5 饮片流动性 流速是测定粉体流动性的指标之一， 一般来说微粉流速快， 表明其流动均匀性理想， 即流动性好［18］； 流动时间越短， 摩擦力越小，流动性越好。 实验结果表明， 甘草微型饮片的流动性明显优于斜片及圆片， 更适合智能配方机的使用， 可大大提高工作人员抓药效率， 同时能改善工作环境。

3.6 应用前景 中药饮片作为中医临床应用的物质基础， 其质量优劣直接影响临床疗效。 微型饮片在一定程度上解决了传统饮片在仓储、 调剂、 服用等方面的问题， 使临床处方中的药物比例更加准确稳定。 它既保留了传统饮片随症加减的特色， 又增加了其实用性， 使临床用药更加方便快捷， 从而保障最强药效。?