短柱八角中二萜类成分及其抗炎活性

2019-01-25吕闪闪孙连娜

中成药 2019年1期

陈伟，吕闪闪，王璇，陈程，孙连娜∗

（1. 菏泽家政职业学院，山东菏泽274300； 2. 上海中医药大学中药学院中药炮制学教研室，上海

201203）

二萜是一种广泛存在于自然界的C20类化合物，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性［1］。八角属木兰科植物广泛分布在东南亚地区，在我国主要见于云南、广东、广西［2］，短柱八角Illicium brevistylum A. C. Smith 是八角属的一种，以灌木为主［3-5］，具有祛风除湿、治疗关节痛等功效［6］。课题组前期已证实短柱八角干皮部位具有较好的抗炎活性［7-9］，可用于关节炎的治疗，具备一定开发前景；本实验进一步对其中二萜类成分进行分离，并对其抗炎作用进行研究，旨在阐明其相关活性物质。

1 材料

安捷伦6540 型四级杆串联飞行质谱仪（美国安捷伦公司）； AVANCE Ⅲ600 MHz 核磁共振仪（德国布鲁克公司）； WFH-201B 暗箱式紫外分析仪（上海驰唐实业有限公司）。 S03230G-A 反相填料（加拿大Silicycle 公司）； Sephadex LH-20 （美国通用公司）； DMEM 培养基和胎牛血清（美国Gibico公司）； RP-18F254硅胶板（德国默克公司）； GF254薄层硅胶（青岛裕宝精细化工有限公司）；布洛芬（珠海嘉亿生物科技有限公司）。 HEK293／NF-κBluc 细胞（上海哈灵生物科技有限公司）。所用试剂均为分析纯。

短柱八角干皮由上海中医药大学孙连娜副教授2011 年10 月在广西省金秀县采集并鉴定为正品，其标本（编号IB1110）保存在上海中医药大学中药炮制教研室。

2 提取分离

短柱八角干燥干皮（10 kg）按照常规提取与萃取流程分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位［6］。取石油醚部位300 g，采用石油醚与乙酸乙酯混合体系进行溶解，挥干溶剂后，进行硅胶柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯（50 ∶1 ～1 ∶1）及纯乙酸乙酯进行梯度洗脱， TLC 检测合并的6 个馏分（P1～P6）。 P1 （18.9 g）经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（30 ∶1 ～15 ∶1）梯度洗脱， TLC 检测合并得到4 个部位P1.1 ～P1.4，P1.2 （2.1 g）经ODS 柱层析，水-甲醇（2 ∶8）洗脱，得化合物1 （15 mg）； P1.2 （5.8 g）经硅胶柱层析，石油醚-丙酮（10 ∶1 ～2 ∶1）梯度洗脱，得化合物2 （11 mg）、 3 （12.7 mg）。 P2（15.3 g）经硅胶柱层析，石油醚-丙酮（20 ∶1 ～7 ∶1）梯度洗脱， TLC 检测合并得到3 个部位P2.1～P2.3， P2.2 （5.8 g）经Sephadex LH-20 柱层析，二氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脱，得化合物4（27 mg）、 5 （26 mg）； P2.3 （6.8 g）经硅胶柱层析，石油醚-丙酮（3 ∶ 1）洗脱，得化合物6（23 mg）。 P3 （23.8 g）经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱， TLC 检测合并得到5 个部位P3.1 ～P3.5， P3.2 （2.1 g）经ODS柱层析，水-甲醇（4 ∶ 6）洗脱，得化合物7（15 mg）； P3.3 （2.8 g）经硅胶柱层析，石油醚-丙酮（2 ∶1）洗脱，得化合物8 （26 mg）； P3.4（1.7 g）经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（3 ∶1）洗脱，得化合物9 （15 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末， ESI-MS m／z： 215 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ： 5.81 （1H，dd， J ＝10.6， 17.6 Hz， H-15）， 5.32 （1H， dd， J ＝1.2， 5.4 Hz， H-7）， 4.92 （1H， dd， J ＝1.2， 17.6 Hz， H-16a）， 4.86 （1H， dd， J ＝1.2， 10.6 Hz， H-16b）， 1.21 （3H， s， H-17）， 0.91 （3H， s， H-19），0.9 （3H，s，H-20）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3） δ：38.9 （C-1）， 18.0 （C-2）， 36.9 （C-3）， 46.5 （C-4）， 45.1 （C-5），25.3 （C-6），121.1 （C-7），135.8（C-8）， 52.2 （C-9）， 35.1 （C-10）， 20.1 （C-11），36.8 （C-12）， 37.1 （C-13）， 47.1 （C-14）， 150.4（C-15）， 109.4 （C-16）， 21.6 （C-17）， 185.7 （C-18），17.2 （C-19），15.4 （C-20）。以上数据与文献［10］基本一致，故鉴定为异海松酸。

化合物2：白色无定形粉末， ESI-MS m／z：301.4 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.27 （1H， d， J ＝8.2 Hz， H-11）， 7.12 （1H， dd，J ＝8.2， 2.0 Hz， H-12）， 7.00 （1H， d， J ＝2.0 Hz，H-14）， 3.05 （1H， t， J ＝17.2 Hz， H-7α）， 2.99（1H， t， J ＝17.2 Hz， H-7β）， 2.93 （1H， m， H-15）， 1.62 （1H， dd， J ＝12.8， 3.8 Hz， H-1α），2.42 （1H， m， H-1β）， 1.68 （1H， d， J ＝12.6 Hz，H-5）， 1.93 （1H， m， H-6β）， 1.83 （1H， m， H-2β）， 1.20 （1H， m， H-3α）， 2.36 （1H， m， H-3β）， 1.75 （1H， m， H-2α）， 1.67 （1H， m， H-6α）， 1.40 （3H， s， H-18），1.34 （3H， brs， H-16），1.33 （3H， brs， H-17）， 1.23 （3H， s， H-20）；13CNMR （150 MHz， CDCl3） δ： 37.9 （C-1）， 18.5 （C-2）， 36.7 （C-3）， 47.5 （C-4）， 54.5 （C-5）， 21.7（C-6）， 29.9 （C-7）， 134.6 （C-8）， 146.7 （C-9），36.8 （C-10），124.0 （C-11），123.8 （C-12），145.6（C-13）， 126.8 （C-14）， 33.4 （C-15）， 24.0 （C-16）， 24.0 （C-17）， 185.7 （C-18）， 16.1 （C-19），25.0 （C-20）。以上数据与文献［11］基本一致，故鉴定为脱氢枞酸。

化合物3：白色细针晶（丙酮）， ESI-MS m／z：337 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ： 3.32（1H， d， J ＝5.6 Hz， 3-OH）， 3.31 （1H， s， 16-OH），3.13 （1H， t， J ＝11.2 Hz， H-3），1.86 （2H，m， H-2）， 1.62 （2H， m， H-15）， 1.74 （1H， m，H-13）， 1.23 （3H， s， H-17）， 1.07 （3H， s， H -20）， 0.91 （3H， s， H -18）， 0.73 （3H， s， H-19）；13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δ： 38.6 （C-1），27.6 （C-2）， 76.2 （C-3）， 38.4 （C-4）， 57.8 （C-5）， 19.2 （C-6）， 42.4 （C-7）， 38.6 （C-8）， 55.1（C-9）， 44.4 （C-10）， 18.4 （C-11）， 26.6 （C-12），47.4 （C-13）， 38.6 （C -14）， 57.8 （C-15）， 77.8（C-16）， 32.2 （C-17）， 28.1 （C-18）， 17.4 （C-19）， 15.7 （C -20）。以上数据与文献［12］基本一致，故鉴定为3， 16α-二羟基-贝壳杉烷。

化合物4：白色无定型粉末， ESI-MS m／z：299.2 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.26 （1H， dd， J ＝8.4， 1.9 Hz， H-12）， 7.21（1H， d， J ＝8.4 Hz， H-11）， 7.14 （1H， s， H-14），5.33 （1H， s， H-16a），5.05 （1H， s， H-16b），2.94（1H， dd， J ＝16.8， 4.6 Hz， H-7a）， 2.83 （1H， m，H-7b）， 2.27 （1H， m， H-1b）， 2.24 （1H， dd， J ＝13.6， 6.2 Hz， H-6a）， 2.22 （1H， m， H-3b）， 2.15（1H， m， H-6b）， 2.13 （3H， s， H-17）， 1.98 （1H，m， H-2b）， 1.58 （1H， m， H-2a）， 1.52 （1H， m，H-5）， 1.47 （1H， m， H-1a），1.30 （3H， s， H-18），1.24 （3H， s， H-20）， 1.12 （1H， m， H-3a）；13CNMR （150 MHz， CDCl3） δ： 38.3 （C-1）， 17.6 （C-2）， 40.8 （C-3）， 50.1 （C-4）， 46.1 （C-5）， 19.9（C-6）， 19.8 （C-7）， 128.8 （C-8）， 139.1 （C-9），40.3 （C-10），119.3 （C-11），123.2 （C-12），138.4（C-13）， 126.2 （C-14）， 148.8 （C-15）， 111.0 （C-16）， 21.1 （C-17）， 25.1 （C-18）， 185.3 （C-19），16.4 （C-20）。以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为8， 11， 13， 15-abietatetraen-19-oic acid。

化合物5：白色无定形粉末， ESI-MS m／z：315.14 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.70 （1H， dd， J ＝8.4，1.8 Hz， H-12），7.64 （1H，d， J ＝1.8 Hz， H-14），7.34 （1H， d， J ＝8.4 Hz， H-11）， 3.68 （3H， s， H-OCH3）， 2.56 （3H， s， H-17）， 2.96 （2H， m， H-7）， 2.34 （1H， t， J ＝12.0，3.0 Hz， H-1β）， 2.23 （2H， dd， J ＝12.6， 3.0 Hz，H-5）， 1.86 （1H， m， H-6β），1.78 （2H， m， H-2），1.71 （2H， m， H-3）， 1.56 （1H， m， H-6α）， 1.50（1H， m， H-1α）， 1.29 （3H， s， H-19）， 1.22 （3H，s， H-20）；13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δ： 18.47（C-2）， 36.6 （C-3）， 47.7 （C-4）， 44.5 （C-5），21.4 （C-6）， 29.9 （C-7）， 135.5 （C-8）， 154.95（C-9）， 37.8 （C-10）， 124.6 （C-11）， 125.9 （C-12），134.6 （C-13），129.4 （C-14），198.1 （C-15），29.7 （C-16）， 26.55 （C-17）， 178.9 （C-18）， 16.5（C-19）， 24.8 （C-20）， 52.0 （C-OCH3）。以上数据与文献［14］基本一致，故鉴定为methyl-16-nor-15-oxodehydroabietate。

化合物6：无色油状物， ESI-MS m／z： 317.2［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ： 6.84（1H， s， H-14）， 6.63 （1H， s， H-11）， 3.13 （1H，m， H-15）， 2.83 （2H， m， H-7）， 2.23 （1H， d， J ＝1.8 Hz， H-5）， 1.56 （1H， dd， J ＝12.8， 3.8 Hz，H-1α）， 2.19 （1H， m， H-1β）， 1.84 （2H， m， H-3）， 1.83 （2H， m， H-6）， 1.53 （2H， m， H-2），1.28 （3H， s， H-19）， 1.24 （3H， d， J ＝6.6 Hz， H-16）， 1.23 （3H， d， J ＝6.6 Hz， H-17）， 1.20 （3H，s， H-20）；13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δ： 36.8 （C-1）， 18.5 （C-2）， 36.7 （C-3）， 47.4 （C-4）， 44.5（C-5）， 21.8 （C-6）， 29.2 （C-7）， 127.0 （C-8），147.7 （C-9）， 37.8 （C-10）， 110.8 （C-11）， 150.6（C-12）， 131.8 （C-13）， 126.7 （C-14）， 26.7 （C-15）， 22.5 （C-16）， 22.7 （C-17）， 185.1 （C-18），16.2 （C-19）， 24.9 （C-20）。以上数据与文献［15］基本一致，故鉴定为12-羟基-脱氢枞酸。

化合物7：白色晶体（甲醇）， ESI-MS m／z：317.1 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：4.86 （1H， d， J ＝1.6 Hz， H-16α）， 4.84 （1H， d，J ＝1.6 Hz， H-16β）， 4.72 （1H， d， J ＝1.6 Hz， H-18α）， 4.68 （1H， d， J ＝1.6 Hz， H-18β）， 1.08（3H， s， H-19）， 1.38 （3H， s， H-20），1.74 （3H，s， H-17）；13C-NMR （150 MHz， CDCl3） δ：25.8 （C-1）， 34.6 （C-2）， 173.4 （C-3）， 149.6 （C-4），41.6 （C-5）， 17.6 （C-6）， 24.3 （C-7）， 129.4 （C-8）， 128.9 （C-9）， 41.4 （C-10）， 40.7 （C-11），38.2 （C-12）， 44.6 （C-13）， 34.7 （C-14）， 145.4（C-15）， 112.8 （C-16）， 28.3 （C-17）， 103.1 （C-18）， 15.8 （C-19），17.8 （C-20），50.1 （C-OCH3）。以上数据与文献［12］基本一致，故鉴定为3， 4-开环海松烷-4， 8 （9）， 15 （18） -三烯-3-酸甲酯。

化合物8： ESI-MS m／z： 331 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz， CDCl3） δ： 7.27 （1H， d， J ＝8.2 Hz， H-11）， 7.21 （1H， dd， J ＝8.2， 2.0 Hz， H-12）， 7.15 （1H， d， J ＝2.0 Hz， H-14）， 3.66 （3H，s， H-OCH3）， 2.91 （1H， t， J ＝17.2 Hz， H-7b），2.89 （1H， m， H-15）， 2.32 （1H， m， H-1β）， 2.30（1H， dd， J ＝12.6， 2.2 Hz， H-5）， 2.24 （1H， m，H-6β）， 2.22 （1H， m， H-2β）， 1.78 （1H， m， H-3α）， 1.66 （1H， m， H-2α）， 1.70 （1H， m， H-3α）， 1.67 （1H， m， H-6α）， 1.55 （6H， s， H-16／17）， 1.49 （1H， m， H-1α）， 1.29 （3H， s， H-19），1.21 （3H， s， H-20）；13C-NMR （150 MHz， CDCl3）δ：38.0 （C-1），18.6 （C-2），36.7 （C-3），47.7 （C-4）， 44.9 （C-5）， 21.7 （C-6）， 30.2 （C-7）， 134.7（C-8）， 147.9 （C-9）， 37.0 （C-10）， 124.2 （C-11），122.1 （C-12），146.2 （C-13），124.9 （C-14），72.3 （C-15）， 31.7 （C-16）， 31.7 （C-17）， 179.2（C-18）， 25.1 （C-19）， 16.6 （C-20）， 52.0 （COCH3）。以上数据与文献［16］基本一致，故鉴定为15-羟基取代松香烷甲酯。

化合物9：白色无定型粉末， ESI-MS m／z：335.2 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：6.13 （1H， t， J ＝1.8 Hz， H-14）， 1.28 （3H， s， H-19）， 1.07 （3H， s， H-20）， 0.97 （3H， d， J ＝4.2 Hz， H-17）， 0.96 （3H， d， J ＝4.2 Hz， H-16）；13CNMR （150 MHz， CDCl3） δ： 33.6 （C-1）， 17.7 （C-2）， 37.5 （C-3）， 47.2 （C-4）， 40.3 （C-5）， 20.7（C-6）， 27.5 （C-7）， 143.9 （C-8）， 82.3 （C-9），38.6 （C-10）， 23.7 （C-11）， 25.3 （C-12）， 79.8（C-13）， 127.2 （C-14）， 32.3 （C-15）， 17.6 （C-16）， 17.3 （C-17）， 183.9 （C-18）， 17.7 （C-19），17.9 （C-20）。以上数据与文献［17］基本一致，故鉴定为9β， 13β-endoperoxide-abieta-8 （14） -en-18-oic acid。

4 抗炎活性检测

293-NF-κB-luc 细胞转至48 孔板（1×104／孔），采用含10% FBS 的DMEM 完全培养液培养24 h，然后将细胞分为空白组（含10%FBS 的DMEM 完全培养液）、正常组（含10%FBS 的DMEM 完全培养液培养的293-NF-κB-luc 细胞）、模型组（1 μg／mL LPS 刺激48 h，含10%FBS 的DMEM 完全培养液培养的293-NF-κB-luc 细胞）、给药组（含有药物、10%FBS 的DMEM 正常培养的293-NF-κB-luc 细胞，同时加LPS 刺激48 h）、阳性药组（含有10 μg／mL布洛芬、 10% FBS 的DMEM 正常培养的293-NF-κB-luc 细胞，同时加LPS 刺激48 h）。

将化合物4 ～6、 8 配制成3 mg／mL 溶液［6］，PBS 稀释成10 μg／mL， MTT 法检测发现上述化合物在10 μg／mL 时不影响细胞的正常生长，因此后续均采用该质量浓度考察抗炎活性。将10 μg／mL化合物与细胞共同孵育 4 h 后，加入 LPS（1 μg／mL）再培养48 h，检测细胞上清液的荧光强度。

实验过程中，化合物1 ～5、 7、 9 质量较少，在保证为后期实验存有对照品的基础上，课题组只对化合物4 ～6、 8 进行了抗炎活性检测。结果表明，三者均能降低LPS 诱导293-NF-κB-luc 的荧光强度，其中5、 8 活性优于阳性药，见表1。

表1 各化合物抗炎活性（±s， n＝3）Tab.1 Anti-inflammatory activities of various compounds（±s， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01

组别荧光强度正常组 356.66±9.01模型组 2 946.00±44.23＃＃化合物4 组 1 522.33±74.11∗∗化合物5 组 894.67±18.88∗∗化合物6 组 1 508.33±54.54∗∗化合物8 组 575.67±24.79∗∗阳性药组 1 338.33±35.53∗∗

5 讨论与结论

本实验从短柱八角中分得9 个二萜化合物，其中化合物1、 7 为海松酸型二萜，化合物3 为贝壳杉烷型二萜， 2、 4 ～6、 8 ～9 为松香烷二萜，均为首次从该植物中分离得到，其中3、 7 为首次从八角属植物中分离得到。药理实验显示，化合4 ～6、8 均具有较强的NF-κB 抑制活性，表明松香烷二萜可能是短柱八角抗炎活性的代表成分，可为其深入研究提供依据。