北豆根配方颗粒质量标准的研究

2019-01-25刘源才龚华梦

中成药 2019年1期

胡辉，刘源才，龚华梦

（1. 劲牌生物医药有限公司，湖北黄石435100； 2. 劲牌研究院，湖北黄石435100； 3. 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶435100）

北豆根系防已科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC. 的干燥根茎，始载于《中国药用植物志》，原名蝙蝠葛根［1］，主产于东北、华北、陕西等地，具有清热解毒、祛风止痛的功效，常用于咽喉肿痛、热毒泻痢、风湿痹痛等［2］，现代药理研究表明其具有良好的抗炎［3］、抑菌［4］、抗心律失常［5］、抗高血压［6］、抗肿瘤［7］作用，其中生物碱类成分蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱是其主要的有效成分［8］。随着中药现代化发展，近几年来对北豆根制剂的研究比较深入，在北豆根片、胶囊之后，又开发出了北豆根分散片、咀嚼片、口腔崩解片、软胶囊、气雾剂、粉针剂、滴丸、缓控制剂，临床上主要用于口腔及咽部的炎症治疗［9］，但尚无用于中医辨证论治的北豆根配方颗粒报道。

北豆根配方颗粒作为中药现代剂型，配方后使用时只需加水冲服即可，因此相较于传统汤剂具有便捷、高效、易贮存等特点，并且该制剂以《中国药典》规定的北豆根饮片为原料，通过水煎煮、过滤、浓缩、干燥、制粒等流程制成，其性味归经、功能主治与原药材相同，规范其质量对临床应用具有十分重要的意义［10］。因此，本实验以2015版《中国药典》中北豆根项下相关内容为参考，建立北豆根配方颗粒质量标准，为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Fisher UltiMate 3000 系列高效液相色谱仪（配置LPG-3400SDN 四元梯度泵、WPS-3000SL 自动进样器、 TCC-3000RS 柱温箱、VWD-3100 检测器、 DAD-3000 检测器）；Quintix125D-1CN 电子天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）； PURELAB Classic 纯水机（英国ELGA 公司）。

1.2 试药蝙蝠葛苏林碱对照品（含有量98%，批号AP154D，天津一方科技有限公司）；蝙蝠葛碱对照品（含有量98.5%，批号111867-201503）、北豆根对照药材（批号120977-201404）（中国食品药品检定研究院）。硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂分厂）。乙腈（批号172009，美国Fisher 公司）、三乙胺（批号P1238512，上海阿达玛斯试剂有限公司）为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。北豆根饮片（湖北正光九资河药业有限公司，批号160801），经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林教授鉴定为防已科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC. 的干燥根茎。北豆根配方颗粒（劲牌生物医药有限公司，批号P20170225、 P20170226、 P20170227、 P20170229、P20170301、 P20170302、 P20170304、 P20170305、P20170307、 P20170309， 1 g／袋，相当于饮片7.1 g）。

2 方法与结果

2.1 TLC 定性鉴别取配方颗粒（批号P20170225、 P20170226、 P20170227）适量，研细，取0.5 g，加乙酸乙酯15 mL、浓氨试液0.5 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL 乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取对照药材0.5 g，同法制成相应溶液。按照2015 版《中国药典》一部通则0502，吸取上述2 种溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（9 ∶1 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图1。由图可知，供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点，表明该方法简便灵敏，专属性强，可用于TLC 定性鉴别。

2.2 醇浸出物含有量测定取各批次配方颗粒，研细，过4 号筛［孔径（250±9.9） μm］，取2 ～4 g，按2015 版《中国药典》醇溶性浸出物测定法项下热浸法测定，以乙醇为溶剂。结果，醇浸出物含有量在38.75% ～45.36% 之间，平均42.70%，RSD 5.43%，表明配方颗粒稳定性良好。

图1 样品TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatogram of samples

2.3 指纹图谱建立

2.3.1 色谱条件 Waters T3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈（A） -0.05%三乙胺（B），梯度洗脱，程序见表1；检测波长290 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品溶液精密称取蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含两者0.2、 0.3 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.3.2.2 供试品溶液精密称取本品粉末约0.1 g， 20%甲醇定容至10 mL，超声30 min 后混匀， 0.22 μm 针头过滤器过滤，即得。

2.3.3 专属性试验取对照品、供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图2。由图可知， 2 种溶液在相同保留时间上都有色谱峰，表明该方法专属性良好。

图2 各成分HPLC 色谱图（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents （Ⅰ）

2.3.4 精密度试验取同一供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得指纹图谱相似度均大于0.872，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液，于1、3、 5、 11、 17、 23 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得指纹图谱相似度均大于0.923，表明溶液在23 h 内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验取同一批号配方颗粒，按“2.3.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得指纹图谱相似度均大于0.978，表明该方法重复性良好。

2.3.7 建立方法按“2.3.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，指纹图谱见图3，再将其导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.130723 版本），测得10 批配方颗粒的相似度均在0.927 以上，显示出良好的稳定性和特征性。

图3 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of ten batches of samples

2.4 含有量测定

2.4.1 色谱条件 Waters T3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-0.05% 三乙胺，等度洗脱（45 ∶55）；检测波长284 nm；柱温20 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按蝙蝠葛碱峰计算，应不低于6 000。

2.4.2 溶液制备

2.4.2.1 对照品溶液精密称取蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含两者0.2、 0.3 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.4.2.2 供试品溶液精密称取本品粉末约0.1 g， 20% 甲醇超声30 min，定容至10 mL，混匀， 0.22 μm 针头过滤器过滤，即得。

2.4.3 专属性试验取对照品、供试品溶液，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图4。由图可知， 2 种溶液在相同保留时间上都有色谱峰，表明该方法专属性良好。

图4 各成分HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents （Ⅱ）

2.4.4 线性关系考察分别精密称取蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品5.4、 8.8 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，得211.68、 346.72 mg／L 贮备液，各取5 mL 置于同一10 mL 量瓶中，得105.84、 173.36 mg／L 溶液，依次稀释2 倍，制得含13.23、 26.46、 52.92、 105.84、 211.68 mg／L蝙蝠葛苏林碱，以及 21.67、 43.34、 86.68、173.36、 346.72 mg／L 蝙蝠葛碱的溶液，命名为DZ-1、 DZ-2、 DZ-3、 DZ-4、 DZ-5，各取10 μL，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为蝙蝠葛苏林碱Y ＝0.111 58X-0.157 42（R2＝0.999 85）、蝙蝠葛碱Y ＝0.158 94X-0.613 92（R2＝0.999 16），分别在13.23 ～211.68、 21.67 ～346.72 mg／L 范围内线性关系良好。

2.4.5 重复性试验取同一批配方颗粒（批号P20170225），按“2.4.2.2” 项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，测得蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含有量RSD 分别为2.78%、 2.33%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 精密度试验取“2.4.4” 项下DZ-5 溶液，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱峰面积RSD 分别为0.74%、 0.25%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验取“2.4.4” 项下DZ-5 溶液，于6、 8、 12、 20、 30、 32 h 在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，测得蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱峰面积RSD 分别为2.62%、 0.53%，表明溶液在32 h 内稳定性良好。

2.4.8 加样回收率试验精密称取含有量已知的同一批配方颗粒（批号P20170225，蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含有量分别为0.595 0%、 2.608 7%）9 份，精密加入各对照品溶液适量，按“2.4.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝9）

2.4.9 样品含有量测定取10 批配方颗粒，按“2.4.2.2” 项下方法制备供试品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

3 讨论

北豆根成分复杂，除了含有大量生物碱外，还含有挥发性成分、多糖、醌类、强心苷、内酯、皂苷、鞣质、蛋白质、树脂等成分［11］，将其制成配方颗粒时，不仅可保留原药材性味、主要有效成分、功效作用，还能提高用药便捷性和药方调配灵活性。本实验测得10 批配方颗粒中醇浸出物平均含有量为42.70%，按测定结果平均值的80% 计算，暂定其含有量不得低于34.16%。

与传统药材饮片相比，配方颗粒失去了外观性状特征，指纹图谱相当于为其贴上了“化学条形码”［12］，使其有了独有质量控制标准。本实验发现， 10 批配方颗粒指纹图谱相似度较高，并具有良好的稳定性和特征性，暂定其相似度不得低于90%。

由于蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱是北豆根主要有效成分，故本实验建立HPLC 法测定两者含有量。结果，两者总含有量平均值为3.160 5%，按测定结果平均值的80%计算，暂定其总含有量不得低于2.528 4%。