微小RNA-23b-3p通过靶向TGFBR3促进人心房肌成纤维细胞纤维化相关基因表达*

杨真祯， 朱文思， 肖 珍， 朱杰宁， 符永恒， 林秋雄， 谭虹虹， 单志新， 吴书林△

[1华南理工大学医学院， 广东 广州 510632； 2广东省心血管病研究所， 广东省人民医院(广东省医学科学院), 广东 广州 510080; 3广东省妇幼保健院， 广东 广州 511400]

心房颤动(atrial fibrillation, AF)又称房颤，是临床常见的心律失常之一。现有的房颤治疗策略还存在局限，不良反应风险发生率较高，疗效不确切,远期复发率较高[1-2]。持续的房颤可导致电重构和结构重构，而心肌纤维化是结构重构的重要特征，现有的实验及临床数据表明，多种因素参与心肌纤维化及房颤的发生过程，包括氧化应激、钙超载、炎症以及肌成纤维细胞的激活等[3]。心房纤维化对心律失常的维持起到关键作用[2, 4]。房颤患者心脏纤维化组织的含量及分布与房颤发生的机制、并发症风险及治疗效果相关[4-5]。心肌纤维化是房颤重要的病理特征，导致细胞外基质的过度沉积，引起心肌重构甚至心力衰竭[6]。目前对于房颤及心肌纤维化的研究尚不深入，相关的病理生理机制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA, miR)是在植物、动物和一些病毒中发现的非编码RNA，含有约22个核苷酸，通过影响靶基因mRNA稳定性和翻译来参与多细胞生物体中基因表达的转录后调控[7-8]。miRNA在多种基因调控途径中发挥关键作用，包括机体发育，造血干细胞分化，细胞凋亡，细胞增殖及器官发育等[9]。miRNA参与调控多种心血管疾病，包括冠状动脉粥样硬化、心肌纤维化、心力衰竭及心律失常等。例如，miR-21通过激活ERK信号通路从而促进纤维化的进展以及房颤的易感性[10]；miR-29在犬房颤心房组织以及血浆中表达降低，而胶原基质同步增加，纤维化水平增高，而其机制主要是miR-29能阻断转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)对胶原纤维以及细胞外基质蛋白分泌的促进作用；此外，miR-30和miR-590均能通过纤维化参与房颤的发展[11-12]。

我们前期miRNA表达谱芯片检测发现，miR-23b-3p在风湿性心脏病伴房颤患者心耳组织中表达显著增强，但其对心肌纤维化的作用尚不明确。本文将初步研究miR-23b-3p在人心肌成纤维细胞中对纤维化相关基因表达的调控作用，明确miR-23b-3p的作用靶基因。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

限制性内切酶XhoI和EcoR I、转染试剂Lipofectamine 2000、TRIzol、逆转录试剂盒、4×SDS protein loading buffer、2×SYBR Green Mix和RNAase-free water(TaKaRa)；miR-23b-3p mimic和TGFBR3 siRNA(广州锐博)；BCA蛋白定量试剂盒和蛋白Marker(Thermo)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Bio-Rad)；抗GAPDH和COL3A1抗体(Protein Technology)；抗COL1A1抗体(Thermo)；抗ACTA2抗体(Abcam)；抗TGFBR3 抗体(Affinity)；PVDF膜和ECL发光液(Millipore)；DMEM/F12细胞培养液、特级澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 主要方法

2.1人心房肌成纤维细胞(human atrial fibroblasts,HAFs)原代分离培养和处理 将经患者知情同意的废弃的手术切除的新鲜心耳组织(本研究经广东省人民医院伦理委员会批准，手术标本来源：广东省心血管病研究所)置于预冷的PBS缓冲液中，只剪取近心房组织，去除淤血。用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化法分离心房肌成纤维细胞。离心弃上清，沉淀用完全培养液(含10 %胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM/F12培养液)重悬，接种于25 cm2细胞培养瓶中，再置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。培养24 h后，更换一次完全培养液。待细胞密度达90%时，消化传代。取第3～7代细胞消化后铺于孔板内，分别将100 nmol/L scrambled对照、 miR-23b-3p mimic和TGFBR3 siRNA转染到HAFs中，24 h后结束实验。

2.2细胞免疫荧光鉴定HAFs中ACTA2表达 第3代的HAFs稳定生长后，用预热的PBS清洗3遍后，4%多聚甲醛室温固定30 min，用0.2% Triton X-100透化5 min，5% BSA室温封闭2 h，加ACTA2 Ⅰ抗(1∶500),4 ℃孵育过夜，加荧光Ⅱ抗室温避光孵育1 h，加入含核染料DAPI的封片剂覆盖细胞，室温孵育5 min后激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2.3CCK-8、EdU和Transwell实验检测HAFs活力、增殖和迁移能力 在96孔板中接种密度合适的HAFs，稳定生长24 h后，分别转染scrambled对照和miR-23b-3p mimic。24 h后每孔加入培养液总体积10%的CCK solution，混匀培养4 h后检测450 nm处的吸光度(A)值。接种合适密度的HAFs于confocal皿中，稳定生长后按上述分组转染细胞，24 h后加入EdU工作液，使其终浓度为50 μmol/L，继续培养12 h，PBS清洗并用4%多聚甲醛固定后按说明书方法染色(Apollo®567染增殖细胞核)，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。在Transwell小室内接种合适密度的HAFs，稳定生长后按上述分组转染细胞，24 h后更换不同浓度血清的培养液，小室外面血清浓度高于小室内，过夜后用PBS清洗细胞并用4%多聚甲醛室温固定30 min，用棉签擦除小室内底部细胞，结晶紫染色液染小室外底部细胞20 min，显微镜下观察并拍照。

2.4RT-qPCR检测TGFBR3和纤维化标志物mRNA及miR-23b-3p的表达情况 用TRIzol法提取HAFs中总RNA。取1 μg总RNA，加入5×逆转录试剂4 μL(逆转录试剂盒)，用Oligo (dT)15和random primers逆转录出cDNA用于检测TGFBR3及纤维化标志物的 mRNA水平,以GAPDH为内参照。取1.0 μg总RNA，用miR-23b-3p特异的RT引物逆转录出cDNA用于检测miR-23b-3p水平，以U6为内参照。在ViiA 7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)进行PCR和结果分析。以2-ΔΔCt法计算TGFBR3、纤维化标志物和miR-23b-3p的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.5Western blot法检测蛋白水平 处理后的HAFs中加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，收集裂解液于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，蛋白质定量后分装，加入4×上样缓冲液，99 ℃加热10 min使蛋白质变性，然后进行SDS-PAGE。用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别用相应的抗体[anti-COL1A1(1∶2 000)、anti-COL3A1(1∶2 000)、anti-ACTA2(1∶2 000)和anti-TGFBR3(1∶1 000)]4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育1 h。ECL发光试剂盒显影，以GAPDH(1∶5 000)为内参照，扫描灰度值并分析蛋白表达相对含量。

2.6双萤光素酶报告基因实验验证 miR-23b-3p与TGFBR3 3’-UTR的结合作用 参照我们已报道方法[13]分别构建包含miR-23b-3p潜在结合序列的TGFBR3 3’UTR重组萤光素酶报告质粒pGL3-TGFBR3-285-292。将HEK293细胞(细胞密度约为每孔1×105)转染1 μg重组萤光素酶报告质粒、100 nmol/L miR-23b-3p mimic或miR-23b-3p-Mut以及20 ng pRL-TK(表达海肾萤光素酶的内参照质粒)。转染后24 h，测定萤火虫萤光素酶(firefly luciferase, FL)及海肾萤光素酶(Renillaluciferase, RL)催化底物的发光强度。FL/RL的变化可反映miR-23b-3p与TGFBR3 3’UTR结合的能力。

3 统计学处理

用SPSS 21.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t检验进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 人心房肌成纤维细胞的分离及鉴定

原代分离的HAFs第2天观察细胞因杂质较多，只可见少量细胞，呈圆形，单个存在。3天后观察，细胞伸展，细胞呈长梭形，胞核明显。约1周后，细胞融合度达到90%，按1∶2比例传代培养。本研究所用HAFs为第3～7代细胞，其成纤维细胞表型在细胞因子刺激下逐步向肌成纤维细胞表型转化，大量分泌细胞外基质，ACTA2表达增多，利用细胞免疫荧光染色实验对HAFs表达的ACTA2进行鉴定，见图1。

2 miR-23b-3p对HAFs活力、增殖及迁移能力的影响

我们将100 nmol/L miR-23b-3p mimic转染入HAFs中，RT-qPCR结果显示，转染miR-23b-3p mi-mic的HAFs中miR-23b-3p水平显著升高(P<0.01)，见图2A。CCK-8及EdU检测显示，与对照组相比，HAFs过表达miR-23b-3p后，细胞活力和增殖能力无显著差异，见图2B、C。同样地，Transwell检测显示，过表达miR-23b-3p对细胞迁移能力无明显影响，见图2D。

Figure 1.The morphology and identification of HAFs. A: cultured HAFs under light microscope (the scale bar=100 μm); B: expression of ACTA2 in HAFs detected by immunofluorescence staining assay (the scale bar=50 μm).

图1人心房肌成纤维细胞的分离及ACTA2表达鉴定

Figure 2.miR-23b-3p had no significant effect on the viability, proliferation and migration of HAFs. A: the expression level of miR-23b-3p in HAFs transfected with miR-23b-3p mimic was detected by RT-qPCR; B～D: the effects of miR-23b-3p on the viability, proliferation and migration of HAFs were detected by CCK-8, EdU and Transwell assays. Scale bar=100 μm. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsscrambled group.

图2miR-23b-3p对人心房肌成纤维细胞活力、增殖及迁移能力的影响

3 miR-23b-3p促进HAFs中纤维化相关基因的表达

RT-qPCR和Western blot检测结果显示，HAFs过表达miR-23b-3p后，纤维化相关基因COL1A1、COL3A1和ACTA2的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05，P<0.01)，提示miR-23b-3p可在转录水平促进纤维化相关基因的表达，见图3。

4 TGFBR3介导miR-23b-3p促进HAFs中纤维化相关基因表达

利用miRDB(www.mirdb.org)和TargetScan (www.targetscan.org)数据库对TGFBR3及miR-23b-3p进行序列分析显示，TGFBR3 3’UTR的285～292碱基可能是miR-23b-3p的结合位点。双萤光素酶报告基因实验证实，miR-23b-3p可与TGFBR3 3’UTR的285～292位点特异性结合，而将miR-23b-3p序列突变后，miR-23b-3p-Mut不能与TGFBR3 3’UTR结合,见图4A。RT-qPCR和Western blot检测发现，过表达miR-23b-3p的HAFs中，TGFBR3的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，提示miR-23b-3p可在转录水平调控TGFBR3的表达(P<0.05或P<0.01),见图4B。在HAFs中，利用TGFBR3 siRNA沉默靶基因TGFBR3的表达以及过表达miR-23b-3p后，Western blot检测显示，TGFBR3 的表达均显著降低，同时p-Smad3水平以及纤维化相关蛋白COL1A1、COL3A1和ACTA2的表达水平均一致性升高(P<0.05或P<0.01)，见图4C。

讨 论

近期研究表明，miR-23b在脓毒症引起的心功能障碍中表达上调，miR-23b靶向抑制TGIF1，激活TGF-β1/Smad2/3信号通路，进而促进心肌成纤维细胞的分化，miR-23b还可靶向抑制PTEN，激活AKT/N-cadherin信号通路，从而导致细胞外基质的沉积[14]。另有研究表明，miR-23b-3p在充血性心力衰竭患者外周血中表达上调，提示miRNA可能在心力衰竭的病理过程中起作用，因为它们可能涉及与疾病进展有关的途径，包括纤维化[15]。miR-23b-3p在心脏疾病中的发挥重要作用，但其心肌纤维中的作用机制尚未完全阐明。

在本文中，我们成功从房颤患者心耳组织中分离并培养HAFs，通过ACTA2免疫荧光染色证实，分离得到的细胞为表达ACTA2表型的肌成纤维细胞，适合用于纤维化表型相关的研究。鉴于心肌成纤维细胞的增殖和迁移也是心肌纤维化的重要特征[16]。我们分别通过CCK-8、EdU染色和Transwell实验检测HAFs的活力、增殖和迁移能力，结果显示miR-23b-3p对HAFs的活力、增殖及迁移能力无明显影响。进一步，通过将miR-23b-3p mimic转染入HAFs，证实miR-23b-3p可显著增强纤维化相关基因COL1A1、COL3A1和ACTA2表达，从而明确miR-23b-3p主要通过增强纤维化相关基因表达来发挥促进心肌纤维化的作用。

Figure 3.miR-23b-3p enhanced the expression of fibrosis-related genes in HAFs. A: the mRNA expression of COL1A1, COL3A1 and ACTA2 was determined by RT-qPCR assay; B: the fibrosis-related protein expression was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 scrambled group.

图3miR-23b-3p促进人心房肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达

已有的研究报道，多种microRNA参与调控心肌纤维化过程,如miR-29a可靶向VEGF-A/MAPK信号通路，抑制心肌成纤维细胞纤维化水平及增殖[17];miR-199a-5p靶向Sirt1促进心肌成纤维细胞中心肌纤维化相关基因表达[18];miR-24可抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达，并且降低心肌成纤维细胞的增殖及迁移能力[19];我们通过序列分析提示TGFBR3可能是miR-23b-3p的靶基因，通过双萤光素酶报告基因实验证实miR-23b-3p与TGFBR3 3’UTR有特异性结合作用;进一步，我们证实miR-23b-3p可在mRNA和蛋白水平抑制HAFs中TGFBR3的表达，说明miR-23b-3p在转录水平抑制TGFBR3表达。功能实验结果表明，miR-23b-3p和TGFBR3 siRNA可一致性地促进HAFs中纤维化相关基因表达。因此，上述结果证实TGFBR3是miR-23b-3p的靶基因，并介导了miR-23b-3p发挥促进HAFs中纤维化相关基因表达的作用。

TGFBR3是TGF-β超家族的共受体，介导TGF-β信号转导，但抑制TGF-β与TGFBR1及TGFBR2的结合作用，发挥抑制TGF-β/Smad3信号通路的作用[20]，并已被证实与多种疾病的发生相关[21-22]。研究显示，miR-21可靶向抑制TGFBR3的表达，从而促进心肌纤维化，而过表达TGFBR3后可抑制miR-21和心肌纤维化水平[23]。在小鼠肺成纤维细胞中抑制TGFBR3的表达可加剧肺纤维化的过程[24]。本文结果表明，miR-23b-3p可抑制HAFs中TGFBR3的表达，激活Smad3信号并增强纤维化相关基因表达。本文结果与以往关于TGFBR3具有抑制心肌纤维化作用的报道一致[23, 25-26]。

Figure 4.TGFBR3 mediated the effect of miR-23b-3p on upregulation of fibrosis-related genes in HAFs. A: dual-luciferase reporter assay; B: the mRNA and protein expression of TGFBR3 in HAFs transfected with miR-23b-3p mimic; C: the protein expression of COL1A1, COL3A1, ACTA2, TGFBR3, p-Smad3 and Smad3 in HAFs after transfection with miR-23b-3p mimic orTGFBR3 siRNA (si-TGFBR3). Mean±SEM.n=3.##P<0.01vspGL3-promoter+scrambled group;*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

图4TGFBR3介导miR-23b-3p促进人心房肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达

综上所述，本文证实TGFBR3是miR-23b-3p的作用靶基因，介导miR-23b-3p激活HAFs中Smad3信号，发挥促进纤维化相关基因表达的作用。在后续研究中，我们将在整体动物水平进一步明确miR-23b-3p对TGFBR3表达和心肌纤维化的调控作用。