少腹逐瘀汤对子宫内膜异位症大鼠MAPK/ERK信号通路的影响*

王金霞， 崔宇红， 成映霞， 范琳琳， 张小花， 范东英

(甘肃中医药大学， 甘肃 兰州 730000)

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)简称内异症，是一种依赖于血管生成和对雌激素敏感的慢性炎症性疾病，在孕龄期不孕妇女患者中发病率高达30%[1]。EM 由有生长功能的子宫内膜(腺体和间质)侵袭、转移到宫腔及其它器官表面而形成[2]，盆腔炎症、血管生成和疼痛[3-4]是其主要的临床症状。EM临床上以手术、药物及其联合治疗为主，降低炎性因子和疼痛介质的水平，阻滞血管生成，有效缓解疼痛。临床常用西药有促性腺激素释放激素激动剂、达那唑和孕三烯酮等，长期服用会抑制排卵，出现更年期综合征等，副作用明显，停药后复发率较高[5]。痛经宝颗粒由当归、肉桂和木香、莪术、五灵脂、丹参、红花和延胡索等9味中药组成，具有温经化瘀和抗炎镇痛的功效[6]。中药少腹逐瘀汤(Shaofu-Zhuyu decoction, SFZY)方剂由当归、川芎、赤芍、肉桂、小茴香等组成，与痛经宝颗粒具有相似功效且能更好地调理妇女全身症状，在EM治疗中被广泛使用，但其作用机制尚不完全清晰。故本研究运用少腹逐瘀汤对子宫异位症大鼠进行干预，拟从丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) /细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路及其关键分子揭示EM的炎症、血管生成机制，并为少腹逐瘀汤在EM临床中应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1实验动物 SPF级SD雌性大鼠60只，体质量(200±30) g，购于甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号为62000600000299和62001000000356。

1.2实验药物与试剂 少腹逐瘀汤处方为当归9 g、生蒲黄9 g、五灵脂6 g、赤芍6 g、小茴香3 g、醋延胡索3 g、没药3 g、川芎3 g、肉桂3 g和炮姜0.6 g。以上药物均购自甘肃中医药大学附属医院，按比例称取少腹逐於汤组方药材5.58 kg，粉碎至粒径40目，分2次煎煮(第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮2 h)，合并煎煮液浓缩至5 kg左右，SD大鼠给药量按照以下计算：人临床用量×0.018/200×得率×1 000×临床等效量的倍数。痛经宝颗粒(国药准字Z41021972)由仲景苑西制药股份有限公司生产。所用ELISA试剂盒均购自上海酶联生物；所用抗体均购自Abcam；RT-qPCR试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购自TaKaRa。引物由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。

2 实验方法

2.1动物模型的建立 参照文献[7]，大鼠常规适应性喂养1周，手术前2 d以戊酸雌二醇0.5 mg/kg灌胃，使大鼠处于统一动情期。造模时用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，碘伏消毒腹部皮肤，铺巾，内异症造模方法参考文献并加以改进，尿道口上方约1 cm处正中开腹，切口约2 cm，找到左侧子宫，在离卵巢约1 cm处，结扎子宫两头，剪下中间的一段子宫(约2 cm)，立即置于生理盐水中，分离附着于子宫浆膜面脂肪组织，纵形剖开子宫，并注意区分子宫内外面。在距腹部切口约1.5 cm处，将分离好的子宫组织内膜面紧贴在右侧腹壁，用无菌4-0可吸收线对角固定两头，青霉素1.6×105U/kg留置腹腔，逐层缝合腹部切口，常规关腹。术后连续3 d肌注青霉素1.6×105U/kg预防感染。

2.2动物分组与给药 将造模成功的大鼠随机分为5组：模型(model)组、痛经宝阳性对照(positive control)组及少腹逐瘀汤低、中、高剂量(low dose of SFZY、middle dose of SFZY和high dose of SFZY)组，每组10只；造模同时另取10只大鼠只行开腹手术，不进行子宫剪切、内膜移植，其余操作同上，作为空白对照(blank control)组。药物干预组给药量按人体给药量换算，少腹逐瘀汤低、中、高剂量组每只大鼠给予相当于生药量2.5 g/kg、5 g/kg和10 g/kg的少腹逐瘀汤药液灌胃；阳性药物组给予0.04 g/kg痛经宝颗粒灌胃；空白对照组和模型组灌胃给予同体积的蒸馏水。每日1次，连续灌胃4周。

2.3HE染色 取大鼠异位子宫组织，置于无菌培养皿中用4%多聚甲醛固定24 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡，苏木素染色，盐酸乙醇分色、伊红染色、中性树胶封片等步骤，光学显微镜下观察并拍照。

2.4ELISA实验 取大鼠异位子宫组织，加入预冷PBS，在冰上研碎，13 000 r/min离心15 min，取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行实验。在抗体包被的96孔板中，分别加入标准品作标准曲线，在其它孔中再加入上清以作实验组，37 ℃孵育30 min后，洗去，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗孵育30 min，洗去，而后依次加入显色液、终止液，最后在酶标仪上以570 nm激发检测吸光度(A)值。

2.5RT-qPCR实验 取大鼠子宫组织约100 mg，液氮研磨后，加TRIzol、氯仿、异丙醇等提取总RNA。取1 μL提取的RNA经超微量分光光度计检测A260/A280的比值在1.8～2.0，提示RNA质量较好。总RNA用 gDNA Eraser处理后，采用逆转录试剂盒将纯化的RNA逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板进行qPCR扩增。实时荧光定量PCR采用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，在Mx3000P实时荧光定量PCR仪(Agilent)上进行，分别扩增ERK、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)和内参照GAPDH(引物序列见表1)。每个反应设3个重复。反应条件为：预变性 95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40循环。扩增结束后确认扩增曲线和熔解曲线，确认得出数据的可信性。采用2-ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequence for RT-qPCR

2.6Western blot实验 取大鼠异位子宫组织，加入裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，离心取上清，加上样缓冲液，煮沸变性后，加到4%浓缩胶浓缩，10%分离胶分离，再经过转膜、封闭、孵育抗体后加发光液，曝光显影，最后进行拍照分析。

3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行数据处理和统计分析。所有数据表示为均数±标准差(Mean±SD)。多组间比较用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用SNK-q法，方差不齐时用Dunnett’s方法分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠子宫组织病理变化

与空白对照组相比，模型组大鼠异位子宫内膜增生明显，有大量血管生成，并伴有大量炎症细胞浸润；与模型组相比，阳性对照组大鼠子宫内膜逐渐萎缩，血管数量和浸润的炎症细胞数量得到有效遏制，与空白对照组基本一致；与模型组相比，随着少腹逐瘀汤剂量的增加，子宫内膜厚度逐渐变薄，血管数量和浸润的炎症细胞数量逐渐减少，其中高剂量组子宫内膜厚度、血管数量和浸润的炎症细胞数量与阳性对照组几乎一致，见图1。

Figure 1.The pathological changes of the uterus of rats (HE staining, ×200).

图1各组大鼠宫腔组织病理变化

2 各组大鼠子宫组织中TNF-α、IL-6及IL-8的变化

与空白对照组相比，模型组大鼠异位子宫组织中TNF-α、IL-6及IL-8含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组及少腹逐瘀汤中、高剂量组大鼠子宫组织中TNF-α、IL-6及IL-8含量显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 子宫组织中TNF-α、IL-6及IL-8含量Table 2.The levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 in the uterus of rats (ng/L.Mean±SD. n=10)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmodel group.

3 各组大鼠子宫组织中ERK、VEGF和MMP-9的mRNA表达变化

与空白对照组相比，模型组大鼠异位宫腔组织中ERK、VEGF和MMP-9的mRNA含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组大鼠宫腔组织ERK、VEGF 和MMP-9的mRNA含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，少腹逐瘀汤中、高剂量组大鼠宫腔组织ERK、VEGF和MMP-9的mRNA含量亦显著降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The mRNA expression of ERK, VEGF and MMP-9 in the rat uterus. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsblank control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

图2大鼠子宫组织中ERK、VEGF和MMP-9mRNA表达量的变化

4 各组大鼠子宫组织中NF-κB、MAPK和MEK蛋白的变化

与空白对照组相比，模型组的NF-κB、MAPK和MEK蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，药物干预组的NF-κB、MAPK和MEK蛋白表达均有所下调，并且随着剂量的增加，NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表达量逐渐减少，其中阳性对照组及少腹逐瘀汤中、高剂量组显著下降(P<0.05)，表明药物可以剂量依赖性地抑制NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表达，见图3。

Figure 3.The protein expression of NF-κB, MAPK and MEK in the rat uterus. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

图3大鼠子宫组织中NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表达

讨 论

本研究将大鼠子宫内膜移植于腹壁建造自体内膜异位症模型，模拟临床上较常见的子宫内膜异位症。少腹逐於汤作为临床上使用广泛的治疗子宫内膜异位症的中药方剂，具有活血化瘀、养血调经、温阳散寒和镇痛抗炎等功效。临床研究表明少腹逐瘀汤及其加减法治疗子宫内膜异位症及伴发痛经疗效显著[8-10]。本研究结果显示，少腹逐於汤治疗子宫内膜异位大鼠后，经HE染色、ELISA、Western blot和RT-qPCR技术检测可知，大鼠内异症症状得到有效改善。

子宫内膜异位症是一种依赖血管生成和对雌激素敏感的炎症性疾病。关于內异症发病机制的学说主要有：经血逆流内膜种植、免疫缺陷和体腔上皮生化等，经血逆流学说居于主导地位。逆流的经血中有大量脱落的内膜间质细胞(可在腹膜、卵巢及其它组织表面种植)和一些其它子宫内膜的组织，可引起局部炎症反应。长期的炎症反应与血管生成、粘连等紧密相关，严重者可致患者疼痛、不孕[11-12]。研究表明，内异症病灶的发生、发展直接依赖于血管的形成[13-14]。VEGF通过雌激素介导可提高血管壁通透性和促进血管生长[15]。子宫内膜异位症患者体内VEGF高表达[16-17]，VEGF与受体结合后激活磷脂酶C和蛋白激酶C，启动MEK-ERK通路促进血管形成。本研究结果显示，模型组中VEGF mRNA表达量较空白对照组、阳性药物组、少腹逐於汤中高剂量组显著升高，说明少腹逐於汤可减少异位组织中VEGF表达量，抑制血管的生成。

本研究结果还发现，模型组中ERK mRNA和MEK蛋白的含量较空白对照组显著增加，而少腹逐於汤可减少异位组织中ERK mRNA和MEK蛋白的含量。这与其它学者研究结果相同：子宫内膜异位症病灶组织中雌激素[18]、ERK[19]的表达量显著增加，降低磷酸化的ERK蛋白水平能显著降低异位内膜细胞的增殖[20]。此外，ERK有利于炎性因子IL-6和IL-8等的表达[21]。在软骨定向分化中高水平的IL-6可激活MAPK/ERK通路[22]，而激活的MAPK/ERK信号通路可促进IL-1、TNF-α和NF-κB生成[23]。本研究中模型组大鼠异位子宫组织中TNF-α、IL-6及IL-8因子的含量显著升高，NF-κB蛋白的表达量显著升高。高含量的炎性因子促使NF-κB蛋白的含量增加，从细胞质移至细胞核内，发挥转录因子活性而调控下游靶基因，可促进TNF-α、IL-6及IL-8的表达，进而使异位子宫炎症加重。本实验中子宫内膜异位症大鼠给予少腹逐瘀汤治疗后，可明显减少异位组织中TNF-α、IL-6及IL-8含量，降低NF-κB蛋白和VEGF的mRNA的含量，表明少腹逐瘀汤可阻滞异位子宫组织中炎性因子的增多和血管生成，缓解异位病灶的发展。

MMP-9可促进内膜异位症异位内膜细胞的迁移和生长[24]，且异位内膜细胞具有较强的产生MMP-9的能力，这使得异位内膜具有更强的水解能力，MMP-9可降解异位内膜周围的基底膜，破坏腹膜间质细胞的连接，使异位内膜在腹腔内易种植、生长并使病灶不断扩大[25]。MMP-9含量在内膜异位症患者体内呈高表达[16-17]。本研究发现，与空白对照组相比，模型组大鼠子宫组织中MMP-9 mRNA的含量显著升高；与模型组相比，少腹逐瘀汤中、高剂量组的大鼠异位子宫中MMP-9的mRNA含量显著降低。

子宫内膜异位症的异位组织中MAPK、ERK、MEK、VEGF和MMP-9的含量较高，激活MAPK/ERK信号通路，该信号通路激活后会促使炎性因子、生长因子等高表达，进而加重子宫内膜异位症的病情。本研究中少腹逐瘀汤可有效抑制NF-κB、MEK、MAPK蛋白与ERK、VEGF、MMP-9 mRNA等的表达，降低TNF-α、IL-6和IL-8的含量。推测，异位子宫组织经少腹逐瘀汤治疗后在雌激素介导下通过MAPK/ERK信号通路下调TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、MEK、MAPK、ERK、VEGF和MMP-9等的表达，抑制异位组织中炎症因子和血管生成，减缓子宫内膜异位症的发生和发展。