SCNM1在乙肝相关性肝癌中的表达及临床意义*

吴珏堃， 熊志勇， 林良奕， 凌云彪

(中山大学附属第三医院 1肝胆外科， 2甲状腺乳腺外科， 广东 广州 510630； 3中山大学附属第三医院岭南医院普外科， 广东 广州 510530)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高且预后差，研究表明其发生发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的过程[1]。目前对于早期肝癌的根治性治疗主要是手术切除、消融和肝移植，且预后较好，但就诊的大部分患者已处于中晚期，失去根治性治疗的机会[2]。因此，寻找可用于肝癌早期诊断的分子指标、预测肝癌患者预后生存的标志物对提高肝癌的早期诊断率和提高患者预后有重要的临床意义。

离子通道(ion channels)是细胞膜上一类贯穿细胞膜的亲水性蛋白质微孔道，是维持机体生命活动的重要组成。研究表明离子通道不仅维持正常机体运转，在肿瘤发生中也有着重要的作用，其中电压门控钠离子通道可改变细胞内钙离子浓度，造成暂时性去极化状态，进而与肿瘤细胞的恶性程度和转移性相关[3]。钠离子通道调节蛋白1(sodium channel modifier 1，SCNM1)是离子通道中的一个类型，它在肝癌中的表达及具体机制作用尚不明了。本研究通过肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库研究SCNM1，验证SCNM1在肝癌中的高表达。在此基础上，本研究拟结合我院临床样本，探讨SCNM1在肝癌尤其是乙肝相关性肝癌中表达差异的临床意义及对预后的影响，为进一步研究SCNM1在肿瘤发生发展中的作用机制提供线索和思路。

材 料 和 方 法

1 数据资料的收集

标本来源于2013年1月～2015年12月在中山大学附属第三医院肝胆外科接收治疗的108例乙肝相关性肝癌患者。组织标本取自肝细胞癌组织和癌旁组织(距离肿瘤边缘≥2 cm)，肿瘤切除后立即取出标本并于-80 ℃冻存。纳入标准：(1)所有病例术前未进行过放射治疗、化学治疗及介入治疗；(2)临床资料完整；(3)术后病理学检查证实为肝细胞癌，同时根据世界卫生组织(WHO)分级标准对肿瘤分化度进行分级。排除标准：(1)合并其它肿瘤；(2)术后1个月内出现严重并发症、复发或死亡；(3)了解本研究同意参加该项目，但不能保证行规律随访的患者。所有患者均签署由医院伦理委员会批准的患者知情同意书，符合医学伦理学规定，其中男92例，女16例；平均年龄(47.5±5.2)岁。

2 方法

2.1肝癌公共数据库的验证 利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)下载并预处理肝癌数据集的mRNA表达数据，TCGA数据集中包含乙肝相关性肝癌和非乙肝相关性肝癌的数据，在Human Protein Atlas数据库中验证SCNM1蛋白在肝癌中的表达水平，使用Oncomine数据库(包括Chen Liver、Mas Liver、Roessler Liver和Wurmbach Liver等共计875例肝癌组织)资料验证SCNM1在肝癌中的表达量。在TCGA数据库中验证SCNM1对乙肝相关性肝癌患者预后的预测作用。

2.2RT-qPCR检测乙肝相关性肝癌组织及癌旁组织中SCNM1的mRNA表达 按RNA提取试剂盒的步骤提取RNA，用分光光度计进行RNA浓度和纯度分析。将提取的总RNA逆转录为cDNA。使用Primer Premier 5.0软件设计SCNM1和内参照β-actin的引物序列(表1)。将1 μL cDNA+0.5 μL目的基因上游引物+0.5 μL 目的基因下游引物+8 μL SYBR+8 μL 双蒸水建立20 μL的反应体系，按“98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，42次循环；72 ℃ 10 min”的反应条件放入PCR仪内进行扩增。计算目的基因的相对表达量，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 RT-qPCR实验引物设计序列

2.3数据资料的处理 整理乙肝相关性肝癌样本患者的临床信息，进行临床病理资料分析。将乙肝相关性肝癌组织中SCNM1表达水平高于癌旁组织2倍的病例归入高表达组，其余病例归入低表达组。

3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，均数比较采用t检验和卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SCNM1在肝癌中的表达

利用TCGA的数据我们分析了SCNM1在371例肝癌病例中mRNA的表达情况，结果显示SCNM1在肝癌中的mRNA相对表达水平明显高于正常肝组织(t=4.077，P<0.01)，见图1。

我们又对Oncomine数据库中的临床样本进行分析，结果发现SCNM1在肝癌组织中的表达量均明显高于正常肝组织(P<0.01)，见图2。

Figure 1. The mRNA expression level of SCNM1 in the hepatocellular carcinoma from TCGA database. Mean±SD.n=371.**P<0.01vstumor group.

图1SCNM1基因在TCGA数据库肝癌中的表达水平比较

Figure 2.The mRNA expression of SCNM1 in hepatocellular carcinoma tissues from Oncomine database.n=875.

图2SCNM1在Oncomine数据库肝癌组织中的表达

为确定SCNM1蛋白表达的临床意义，我们对Human Protein Atlas 数据库中的临床样本进行分析，结果发现SCNM1在肝癌组织中的表达量均明显高于正常肝组织，见图3。

2 SCNM1在乙肝相关性肝癌细胞内分布

为了解SCNM1蛋白在细胞中的分布情况，我们查找Human Protein Atlas 数据库中的数据进行分析，数据库收集了肝癌及肝正常组织的免疫组化图片，结果发现SCNM1主要分布于细胞核中，见图4。

3 SCNM1在乙肝相关性肝癌组织及癌旁组织中的表达

RT-qPCR结果显示，乙肝相关性肝癌组织中SCNM1的mRNA中位表达水平明显高于其配对癌旁组织(t=8.082，P<0.01)，见图5。

Figure 3.The expression of SCNM1 in hepatocellular carcinoma tissues from Human Protein Atlas database (×4).

图3SCNM1在HumanProteinAtlas数据库的肝癌组织中的表达

Figure 4.Distribution of SCNM1 protein in the hepatocellular carcinoma cells.

图4SCNM1蛋白在肝癌细胞中的分布

Figure 5. The mRNA expression level of SCNM1 in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma tissues. Mean±SD.n=108.**P<0.01vsadjacent.

图5SCNM1在乙肝相关性肝癌中的表达水平

4 SCNM1的表达水平与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系

将乙肝相关性肝癌组织中SCNM1表达水平高于癌旁组织2倍的病例归入高表达组，其余病例归入低表达组。关联分析显示，乙肝相关性肝癌患者中SCNM1表达水平与肝硬化、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和肿瘤大小具有相关性(P<0.05)，而与患者的性别、年龄和有无肿瘤包膜侵犯等临床病理特征相关性无统计学显著性，见表2。

表2SCNM1表达与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关联分析

Table 2. Correlation analysis between the mRNA expression of SCNM1 and clinicopathological features of the patients with hepatitis B-related hepatocellular carcinoma

Clinicopathological featureSCNM1 mRNA expressionLow expression(n=40)High expression(n=68)2 P Age (year) ≤5521483.5720.059 >551920Sex Male36561.1670.280 Female412Cirrhosis Yes124918.125<0.001 No2819Splenomegaly Yes1092.4040.121 No3059ALB (g/L) >40 20290.5490.459 ≤402039TB (μmol/L) >17 32461.9160.166 ≤17822ALT (U/L) >40 19518.3520.004 ≤402117AFP (μg/L) >400 19422.0850.149 ≤4002126Tumor size (cm) >5 16414.1620.041 ≤52427Degree of differentiation Well differentiated 9160.0150.903 Moderately differentiated and poorly differentiated3152Microvascular invasion* Yes 13161.0320.310 No2752Tumor capsule Incomplete 27531.4300.232 Complete1315

*mainly depended on the pathology report from The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. ALB: albumin; TB: total bilirubin; ALT: alanine aminotransferase; AFP: alpha-fetoprotein.

5 SCNM1的mRNA表达与乙肝相关性肝癌预后的相关性

为分析SCNM1的表达与乙肝相关性肝癌预后的相关性，我们从TCGA数据库中下载了乙肝相关性肝癌SCNM1的mRNA表达数据和相应肿瘤患者生存时间数据。利用Kaplan-Meier plotter对这些肿瘤的数据集进行在线生存分析。结果发现，SCNM1的表达与肝癌患者的总生存率有相关性(HR=1.53，P=0.016)，SCNM1的mRNA表达水平越高，肝癌患者总生存时间越短，见图6A。我们进一步分析了乙肝相关性肝癌的总生存率和无复发生存率，结果发现，SCNM1的mRNA表达与乙肝相关性肝癌总生存率相关(HR=2.41，P=0.015)，见图6B。

Figure 6.The effect of SCNM1 expression on the survival rate of hepatocellular carcinoma patients (A) and hepatitis B-related hepatocellular carcinoma patients (B).

图6SCNM1对肝癌及乙肝相关性肝癌病人生存率的影响

讨 论

本文提供的数据分为数据库数据和我们自己收集的标本。我们自己收集的标本均为乙肝相关肝癌，数据库中包括有乙肝和非乙肝的肝癌样本，预后分析使用的是数据库的数据，所以总的肝癌样本分析一次，把本研究组收集的乙肝相关肝癌样本再分析一次。

研究表明，离子通道可通过调节信号通路的下游效应物分子进行表观遗传学和基因表达的调控修饰，肿瘤中离子通道异常表达或活性改变可调控肿瘤细胞的增殖和凋亡，其中钾和钙离子通道可参与调节肿瘤新生血管形成，钠和氯离子通道调控肿瘤的侵袭转移能力[4]。进而有研究报道，离子通道通过膜蛋白负责细胞内和细胞间的信号传导、细胞外事件与细胞内应答的偶联以及维持细胞内离子稳态在肿瘤发生的病理生理层面有着重要作用[5]。

根据钠离子通道被激活方式的不同，主要分为电压门控钠离子通道、酸质子门控钠离子通道和浓度门控钠离子通道3大类。最新研究表明，钠离子通道在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及非小细胞肺癌等多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关[6]。SCNM1是一类锌指蛋白和剪接因子，在小鼠中，SCNM1改变SCN8A(MIM 600702)突变的表型表达，进而调控钠离子通道。

本研究利用TCGA的数据分析了SCNM1基因在肝癌中mRNA的表达情况发现SCNM1在肝癌中的表达明显高于正常肝组织，利用临床肝癌标本分析发现SCNM1在乙肝相关性肝癌中的表达同样明显高于癌旁组织。我们利用Human Protein Atlas 数据库中的样本对SCNM1的细胞内水平进行分析发现SCNM1主要分布于细胞核中，关联分析显示，乙肝相关性肝癌患者中SCNM1表达水平与肝硬化、ALT和肿瘤大小具有相关性，而与患者的性别、年龄和肿瘤包膜等临床病理特征无相关。生存分析表明，SCNM1的表达与肝癌及乙肝相关性肝癌患者的总生存率均具有相关性，SCNM1表达越高，肝癌及乙肝相关性肝癌患者总生存时间更短。

本文通过生物信息学分析及临床数据为SCNM1基因的研究提供了基础。综上所述，SCNM1与乙肝相关性肝癌的发生发展有着密切相关性，对其深入的研究可进一步揭示其在乙肝相关性肝癌中的功能及作用机制，为肿瘤的预防和治疗提供新的思路。