人胱抑素C大肠杆菌表达载体构建及包涵体复性研究

何 庆，刘 帅，周海霞

（德州学院 生命科学学院 功能性生物资源开发与利用省高校重点实验室，山东 德州 253023）

胱抑素C（CysC）又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，可由人体中所有的有核细胞产生，其基因表达速度稳定，且无组织特异性［1］.人CysC分子量较小，能够通过肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，不返回血液，而肾小管上皮细胞并不向管腔内分泌CysC，因此CysC是目前临床广泛采用的一种反映肾小球滤过率变化的理想标志物［2-3］.目前国外对于人源性CysC蛋白晶体结构以及纯化手段研究较为成熟［4-5］，但国内此类研究和报道较少，且国内目前使用的CysC检测试剂盒及其核心原料均由国外提供.鉴于CysC蛋白在临床和检验中的重要意义，有必要对人cysC基因表达及蛋白纯化、复性进行深入研究，本研究采用基因工程的方法构建了人cysC大肠杆菌表达载体，并探讨了CysC蛋白包涵体胞外复性的方法，为降低体外诊断试剂的成本，提高产品竞争力做出了一定的贡献.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒：大肠杆菌E.coli DH5α、BL21菌株由本实验室保存，原核表达载体pET32a购自TaKaRa公司.

1.1.2 试剂：BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA分子量标准和蛋白质分子量标准购自New England Biolabs公司；D人基因组DNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒等购自OMEGA公司；十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）及各类抗生素购自Sigma公司；兔抗人CysC多克隆抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG、DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；人cysC基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列：5’-CGGGATCCTCTCCGGGTAAACCGCCG-3’，下游引物序 列 ：5’-CCCAAGCTTAGCGTCCTGGCAGGTAGA-3’；8～14ku孔径透析袋为德国Merck产品.

1.1.3 仪器：PCR扩增仪、电转化仪、核酸电泳仪、蛋白电泳仪为Bio-Rad产品；紫外分光光度仪为HITACHI产品.

1.2 方法

1.2.1 重组表达载体及菌株构建：以人基因组DNA为模板克隆人cysC基因，回收纯化目的片段，采用BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶对目的片段进行消化，获得cysC基因片段.将cysC基因片段经与BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶处理的pET32a原核表达载体通过DNA连接酶链接，获得重组表达载体pET32a-cysC.使用电转化将重组表达载体转入E.coliDH5α感受态菌株中，挑取平板阳性菌株进行培养，提取质粒DNA进行限制性内切酶酶切鉴定.同理，使用电转化将经鉴定的重组表达载体pET32a-cysC转入E.coliBL21感受态菌株中，挑取阳性菌株进行培养，提取质粒DNA进行限制性内切酶酶切鉴定.

1.2.2 人CysC诱导表达及鉴定：将经鉴定的重组BL21-cysC菌株接种于100ml新鲜LB培养基中，37℃培养至对数生长中期时，加入0.4mmol/L IPTG进行诱导表达，4h后10000rpm离心培养液，弃上清.5ml PBS缓冲溶液重悬沉淀，并进行超声破碎，采用SDS-PAGE检测破碎后上清和沉淀中人CysC蛋白表达情况.

1.2.3 人CysC蛋白纯化及复性：扩大培养并收集IPTG诱导培养4h的重组BL21-cysC菌株，超声破碎，通过镍柱纯化CysC蛋白包涵体及可溶性上清，采用透析法对纯化产物进行复性，复性缓冲液1配方：20mmol/L Tris-HCl、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mol/L精氨酸、1.33mmol/L还原性/氧化性谷胱甘肽、0.8mol/L脲，pH=8.0；复性缓冲液2 配方：20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.02%叠氮化钠，pH=8.0.复性温度控制在2～8℃.

1.2.4 复性后CysC蛋白免疫反应性检测：采用Western Blotting检测复性后CysC蛋白免疫反应性.

2 结果

2.1 cysC基因表达载体构建

对重组E.coli DH5α菌株质粒采用BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶，结果阳性，证明cysC基因表达载体构建成功.见图1.

图1 重组质粒限制性内切酶酶切产物电泳图（通道1：pET32a-cysC；通道M：DNA分子量标准）

2.2 重组BL21-cysC菌株诱导表达情况

从图2可以看出，沉淀和上清中均有pET32a-cysC蛋白表达，且沉淀中表达量更高，表明pET32a-cysC蛋白大部分以包涵体形式存在，小部分可溶于上清中.

图2 IPTG诱导重组BL21-cysC菌株表达CysC蛋白（通道M：蛋白质分子量标准；通道1：超声破碎后沉淀物；通道2：超声破碎后上清）

2.3 重组CysC蛋白纯化和复性

采用Western Blotting检测纯化和复性后CysC蛋白，图3中可见分子量约34kD大小的重组CysC蛋白，表明重组CysC蛋白具有一定免疫学活性.

图3 纯化后CysC蛋白检测（通道M：蛋白质分子量标准；通道1：CysC蛋白纯化产物）

图4 复性CysC蛋白Western Blotting分析

3 讨论

表达载体对基因表达和蛋白质结构及其活性具有很大的影响，并能影响蛋白质纯化及复性［6］.本研究采用pET32a作为cysC基因表达载体，采用IPTG诱导cysC表达，我们发现重组CysC在pET32a中尽管大多数为包涵体形式，但有部分以可溶性形式存在，这与李江峰等［7］报道CysC在pET28a、pCold1等表达载体中均已包涵体形式存在有差异.这种差异的实际益处在于可溶性重组CysC的后续纯化和复性操作更为简单.重组CysC蛋白包涵体形成至少与两方面原因有关，一是CysC蛋白中存在两个二硫键和较为复杂的β-片层结构，真核生物蛋白在原核表达载体中表达及修饰过程中难以进行正确折叠，造成疏水基团暴露［8］；二是与表达载体使用的蛋白质标签所具有的的功能有关，本研究采用的pET32a中使用的是His标签，分子量较小，有利于目标蛋白的纯化、分析，对其折叠并不会造成太大的影响，有助于在复性过程中获得具有更高生物活性的蛋白［9］.

包涵体复性的目的是获取有生物学活性的蛋白，是极为关键的步骤.本研究在复性缓冲液体系中引入还原性/氧化性谷胱甘肽的目的在于促进重组CysC蛋白形成正确的的二硫键，在其他蛋白表达时可根据特定蛋白二硫键数量适当调整还原性和氧化性谷胱甘肽的比例［10］.精氨酸能够避免复性中重组CysC蛋白相互聚集，具有稳定蛋白质的作用.本研究通过Western Blotting检测分析复性CysC蛋白的免疫学活性，结果显示有部分重组蛋白表现出免疫学活性.提示本研究所采用的复性方法能够一定程度地恢复重组蛋白质的生物学活性.

综上，本研究成功构建大肠杆菌cysC表达重组工程菌，经纯化、复性得到的重组CysC蛋白具有一定免疫活性，为今后cysC基因原核表达和复性提供了一定借鉴，在一定程度上为今后CysC的生产和临床应用提供了一定方法学基础.