银杏叶提取物对1型糖尿病大鼠左心室收缩功能的影响

郑磊 迟婷婷 王圣凯 胡苏琴 陈斌 李剑敏

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺乏或其生物活性受损引起、以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，可引起心血管、肾脏、眼及神经的慢性损害[1]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作为DM严重并发症，可明显增加DM患者发生心力衰竭的风险，已成为DM患者死亡的主要原因之一，但目前临床尚缺乏有效的防治方法。银杏叶提取物（extract of Gingko biloba，EGB）是从银杏叶中提取的传统中药，具有抗氧化、抗凋亡、保护心肌等作用[2-4]，已被用于治疗多种心血管疾病[5-6]。本研究应用链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导建立1型DM大鼠模型，并用EGB进行干预治疗，采用常规超声心动图、速度向量成像（velocity vector imaging，VVI）及心导管等检测评价该方法对DM大鼠左心室收缩功能的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 30只，鼠龄 40～50d，体重 180～220g，由温州医科大学实验动物中心购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2 仪器和试剂 德国Simens公司Acuson Sequoia 512C彩色多普勒超声诊断系统，配备15L8w-S线阵探头，频率为12～14MHz；成都泰盟科技有限公司HX-300动物呼吸机。EGB溶液购自北京双鹤高科天然药物有限公司；STZ、天狼星红染色试剂购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立、分组及干预 所有大鼠适应性喂养1周，禁食不禁水12h后，随机分为正常对照组（CON组）、糖尿病模型组（DM组）和银杏叶提取物干预组（EGB组），每组10只。其中后两组用腹腔注射1%STZ 溶液 65mg/kg（注射前用 0.1mol/L，pH 4.0～4.4 的柠檬酸缓冲液配制）以诱导建立1型DM模型，CON组腹腔给予等体积的柠檬酸缓冲液。分别于注射STZ后第1、3、7天尾静脉取血测定血糖浓度，血糖值均稳定在16.7mmol/L以上视为造模成功。EGB组参考前期实验研究[7]，于腹腔注射EGB溶液8mg/（kg·d）进行干预治疗，而DM组和CON组则给予等体积的0.9%氯化钠溶液腹腔注射。所有大鼠自由进食、饮水，饲养12周。12周后，测定各组大鼠血糖和体重。

1.2.2 超声心动图检测及VVI分析 干预12周后，各组大鼠用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后行常规超声心动图检测，测量各组大鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。随后启动VVI成像模式，连续采集3个心动周期乳头肌水平左心室短轴观的二维灰阶动态图像，所有动态图像存入 MO光盘后，导入 Siemens Sygno US Workplace3.01分析软件进行脱机分析，测定左心室6个室壁节段的收缩期平均峰值速度（Vs）、径向应变（Sr）及径向应变率（SRr），获得相应曲线（图1）。由2位不同操作者分别进行VVI参数的测量及数据分析进行数据的重复性检验。

1.2.3 心导管检测 所有实验大鼠充分麻醉固定后，切开颈前区皮肤，分离气管，接动物呼吸机，打开胸腔，肝素生理盐水充盈心导管后，将心导管从心尖处直接插入大鼠左心室内，经过生物信号转换器转换后，Chart5 for Windows软件同步记录左心室收缩末压力（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）、左心室舒张末压力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP） 及左心室内压最大上升/下降速率（the maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，LV±dp/dtmax）[8]。

1.2.4 心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）测定 处死大鼠，取出心脏，切取乳头肌水平左心室心肌组织，用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后切片，进行天狼星红染色，严格按照试剂盒说明书进行操作。封片后置于光学显微镜下观察。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析测量心肌CVF，每组取12张切片，每张切片随机取20个200倍视野，根据CVF（%）=胶原面积/总面积×100%，取平均值。

1.2.5 心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）检测取各组大鼠心肌组织切片，按照TUNEL凋亡染色试剂盒说明书进行操作，光学显微镜下进行观察。每组取12张切片，每张切片随机取20个400倍视野，计算该视野下所有细胞中染色阳性的细胞数及细胞总数，AI%=视野内的阳性细胞数/视野内的细胞总数×100%。每组取12张切片，每张切片随机取20个400倍视野，取其均值。1.3 统计学处理 采用SPSS Statistics 19.0统计软件，计量资料以表示，多组样本均数比较进行方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者进行Dunnet’sT3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 实验大鼠VVI心肌速度、应变、应变率曲线（a：速度曲线；b：径向应变曲线；c：径向应变率曲线）

2.1 各组大鼠血糖、体重的比较 干预12周后，DM组大鼠死亡2只，EGB组大鼠死亡3只。与CON组大鼠相比，DM组及EGB组大鼠血糖明显增高，体重明显降低（P＜0.05）；与DM组大鼠相比，EGB组血糖显著降低，体重明显增高（P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠血糖、体重的比较

2.2 各组大鼠常规超声心动图及VVI指标比较 DM组及 EGB 组大鼠 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr均明显低于CON 组（均P＜0.05），EGB 组 LVEF、LVFS、Vs、Sr及SRr较 DM 组均明显增高（均P＜0.05），见表2。2位观察者之间VVI数据测量重复性良好。

2.3 各组大鼠左心室血流动力学指标比较 EGB干预12周后，DM组及EGB组大鼠LVESP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均明显低于CON组（均P＜0.05），LVEDP明显高于 CON 组（P＜0.05），EGB 组 LVESP、+dp/dtmax及-dp/dtmax较DM组均明显增高（均P＜0.05）；LVEDP明显减低（P＜0.05），见表 3。

表2 各组大鼠常规超声心动图及VVI指标比较

表3 各组大鼠左心室血流动力学指标比较

2.4 各组大鼠病理学检测结果比较 EGB干预12周后，天狼星红染色结果显示心肌胶原纤维呈红色，CVF测定值显示DM组及EGB组较CON组明显增高，EGB组较DM组明显减低。TUNEL染色显示凋亡细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈蓝色。AI测定值显示DM组及EGB组较CON组明显增高，EGB组较DM组明显减低。见图2、3（见插页）和表4。

表4 各组大鼠CVF、AI测定值比较（%）

3 讨论

DCM的发生、发展机制尚未明了，但由DM引起的心肌细胞凋亡、心肌间质纤维化等一系列心肌结构的改变，进而导致心肌顺应性降低，心功能异常，被认为是DCM发生、发展的重要因素[9-10]。因此，减少心肌细胞凋亡，抑制心肌间质纤维化成为防治DCM的关键策略。本研究结果表明，STZ诱导的1型DM大鼠模型12周时，CVF及AI测定值明显高于CON组，说明DM大鼠在12周时已经出现了明显的心肌细胞凋亡及心肌间质纤维化，也是DCM的显著特征。

EGB是从银杏叶中提取的活性物质，其主要活性成分为黄酮类及萜类内酯化合物[3，11]，具有清除自由基、抗氧化的作用，萜类内酯化合物具有抑制血小板活化因子及炎症分泌物的作用，因此，EGB对DCM的防治具有巨大潜力。本研究结果发现EGB组血糖较DM组明显降低，说明EGB具有一定程度调节血糖的作用，但是调节范围有限，无法调节至正常水平。

VVI技术基于斑点追踪原理，采用超声像素的空间相干、边界追踪等技术，在二维动态灰阶图像上追踪感兴趣区内的声学斑点，自动追踪其运动，以矢量方式显示组织运动的方向、速度及距离等，可全面定量分析心肌组织径向及周向的运动，较为准确地对整体及局部心肌功能进行定量评估。与传统的多普勒技术相比，VVI不受角度的影响，可多切面进行分析，不受心脏搏动和呼吸的影响，且操作简便、无创、可重复性好，因此，在心脏功能定量评价方面较常规超声及组织多普勒等技术更有优势[12-13]。

本研究通过腹腔注射EGB对DM大鼠进行干预，并应用常规超声心动图、VVI及心导管检测左心室收缩功能，结果发现EGB组LVEF、LVFS及VVI所测得的Vs、Sr、SRr等收缩功能指标较DM组增高，心导管检测左心室血流动力学指标也证实EGB组大鼠左心室收缩功能较DM组明显改善，同时，EGB组CVF及AI测定值明显低于DM组，说明EGB可以减少心肌细胞凋亡，减轻心肌间质纤维化，有效改善DM大鼠左心室收缩功能，有效预防DCM的发生。

本研究尚存在一些局限性。首先，DCM的发病机制较为复杂，EGB是否通过其他机制预防DCM还有待进一步研究；其次，干预12周后，EGB组虽然较DM大鼠心功能有所改善，但仍然出现了心肌病理改变。因此，今后应进一步深入研究和优化给药剂量、时间以及是否可以结合其他药物共同干预，取得更满意的效果。