中孕期母血清甲胎蛋白异质体L2和L3筛查胎儿唐氏综合征的临床价值

陈益明 卢莎 连结静 梅瑾 顾琳媛 张艳珍 张闻 褚雪莲 王昊 王敏

唐氏综合征（Down’s syndrome，DS）又称 21-三体综合征、先天愚型，是新生儿出生缺陷常见的一类遗传性疾病，是第21号染色体比正常人多出一条而导致以智力发育障碍为主要特征的综合征[1-2]。产前筛查是指通过简便、经济和较少创伤的检测方法，从母体血清中筛查胎儿患DS的风险性[3]，目前多采用中孕期母血清中甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游离人绒毛膜促性腺激素β亚基（freeβsubunitofhumanchorionicgonadotropin，free β-HCG）、游离雌三醇（unconjugated Estradiol，uE3）等标志物进行筛查[4-5]。AFP 作为 DS 产前筛查中主要标志物之一已经在各地常规开展，但检测灵敏度均较低[6]。血清中AFP与小扁豆素（lensculinaris agglutinin，LCA）结合后，经电泳分成三带，依次命名为 AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即 LCA 非结合型（AFP-L1、AFP-L2）和 LCA 结合型（AFP-L3）[7]。通常把与LCA结合的不同构型的AFP称为AFP异质体，它是新一代的肿瘤标志物[8]。有研究表明AFP-L2或AFP-L3在筛查DS方面优于AFP[9-10]，但有关AFP-L2和AFPL3联合筛查DS方面的报道较少，因此，笔者选择61例健康胎儿孕妇和88例产前诊断为DS胎儿的孕妇作为研究对象，探讨母血清AFP-L2和AFP-L3水平与DS胎儿之间的关系及联合筛查的效能情况，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 回顾2007年10月至2016年9月来自杭州市妇产科医院（杭州市妇幼保健院）366 355例和杭州市余杭区妇幼保健院96 943例共2家产前筛查中心产前门诊、妊娠15～20+6周的单胎孕妇463 298例。根据孕妇妊娠结局有无胎儿DS将研究对象分为病例组和对照组，病例组为经羊水细胞染色体核型分析确诊为DS胎儿的孕妇88例，对照组为随机抽取同时期胎儿发育正常的孕妇61例。两组孕妇的年龄、孕期及体重比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组孕妇一般资料的比较

1.2 诊断和排除标准 病例诊断依据中国出生缺陷监测网制订的诊断标准[11-12]，其主要特征如下：（1）眼距宽（＞2.5cm）；（2）塌鼻；（3）外眦上斜；（4）全身肌张力低；（5）双侧或单侧通贯手和（或）高位三叉点t；（6）小指短小，其中节短或缺如；（7）Ⅰ、Ⅱ趾距宽（草鞋足）；（8）拇趾球部胫侧弓状纹；（9）低位耳。以上特征中有5项组合再结合其他特点可初步筛查为DS，确诊需作染色体检查。染色体分析：以核型47，XX（或XY）+21最常见，占94%～95%；1%～2%为 21-三体嵌合型；2%～3%为易位型，包括D/G易位和G/G易位。排除标准：（1）双胎、多胎妊娠；（2）合并其他内科疾病如胰岛素依赖性糖尿病及严重妊娠并发症；（3）吸烟；（4）试管婴儿；（5）随访结果为18-三体、13-三体、神经管缺陷以及其他出生缺陷；（6）资料信息不全者；（7）孕妇信息与血清标本不匹配者。

1.3 方法

1.3.1 试剂和仪器 2家筛查中心统一使用1235 Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪（美国Perkin Elmer公司）进行产前筛查检测，配套双标记试剂盒（AFP/free β-HCG）、增强液、洗液、质标品和标准品（美国Perkin Elmer公司）；采用 RT-6100酶标仪（美国Rayto公司），988洗板机（北京 Tianshi公司），AFP-L2（美国BIM公司）和AFP-L3试剂（美国BIM公司）。

1.3.2 检测方法 抽取空腹外周静脉血2～3ml，30min后分离血清标本并保存于2～8℃冰箱，于1周内送检，产前筛查指标为AFP和free β-HCG。产前筛查检测结束后多余血清标本储存于-80℃冰箱保存。累积到一定数量后集中检测AFP-L2和AFP-L3水平，检测前将病例组和对照组的信息资料与储存的血清标本进行匹配，并将血清标本进行低温离心混匀和批量检测，应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测AFP-L2和AFP-L3水平。

1.4 妊娠结局随访 每例筛查对象均在新生儿出生前后进行三级网络随访，对孕期发生自然流产、死胎或死产的胎儿进行相关检查以确诊，并对新生儿进行常规体格检查。按照《中国出生缺陷监测方案》填报《出生缺陷儿登记卡》，出生缺陷诊断按国际疾病分类标准（ICD-10）进行分类诊断。

1.5 风险估计 DS的风险值通过将DS的年龄风险值与对应正态分布似然比值相乘计算[13]，年龄风险值计算方程取自Cuckle等[14]研究结果。建立不同模型对DS筛查效能进行比较，通过AFP-L2、AFP-L3多指标以建立模型形式对DS筛查效能比较分析，使用AFP-L2、AFPL3构建的风险计算模型相比于原单独使用AFP MoM值作为单截断的方式有更好的筛查效能。AFP-L2、AFP-L3的MoM值服从多元正态分布f（AFP-L2 MoM，AFP-L3 MoM），按照风险计算模型的建模方法，可以计算得出各指标分布的对应参数，模型通过计算分布似然比作为DS风险[13]。使用相同的原理分别构建四个模型：模型一：AFP+free β-HCG；模型二：AFP-L2+free β-HCG；模型三：AFP-L3+free β-HCG；模型四：AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件，正态性检验采用One-sample Kolmogorov-Smirnov检验，正态分布的计量资料以 表示，组间比较采用独立样本t检验。ROC曲线与最佳切值计算[15]，并计算AFP-L2和AFP-L3的最佳临界值、AUC、灵敏度、特异度、约登指数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇血清AFP-L2、AFP-L3水平比较 DS组孕妇血清AFP-L2高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；DS组孕妇血清AFP-L3高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表 2。

表2 两组孕妇血清AFP-L2、AFP-L3水平比较

2.2 AFP-L2和AFP-L3单独筛查DS胎儿的价值 AFPL2 筛查 DS 胎儿的 AUC=0.891（95%CI∶0.841～0.941），P＜0.01。根据ROC曲线计算出AFP-L2筛查DS胎儿的最佳临界值为6.24 ng/ml，其灵敏度、特异度、约登指数分别为：0.721、1.000、0.721；AFP-L3 筛查 DS 胎儿的AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。AFP-L3 筛查DS胎儿的最佳临界值为1.75ng/ml，其灵敏度、特异度、约登指数分别为：0.663、0.967、0.627。见图 1。

2.3 AFP-L2和AFP-L3联合筛查DS胎儿的效能 不同建模方式结果比较，以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG筛查 DS 胎儿的 AUC 最高=0.929（95%CI：0.861～0.975），P＜0.01。最佳临界值为1/1 636时，此时的灵敏度、特异度、约登指数分别为：0.907、0.857、0.764，不同建模 AUC的高低顺序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFPL2+free β-HCG＞AFP-L3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG，见表3和图2。

图1 AFP-L2、AFP-L3等单项指标筛查DS的ROC曲线

表3 AFP、AFP-L2、AFP-L3单独筛查和联合筛查DS效能分析

3 讨论

目前DS产前筛查方法，一般是采用AFP+free β-HCG二联法筛查或AFP+free β-HCG+uE3三联法筛查，这些筛查方法的灵敏度只有 60%～70%[3-4，6]，为提高DS筛查的灵敏度，临床上不断在寻找新的DS筛查标志物，有研究表明AFP-L2或AFP-L3筛查DS方面优于传统的AFP筛查[9-10，16-17]，但尚未见有关AFP-L2和AFP-L3联合free β-HCG筛查DS方面的报道，因此，本研究选择61例健康胎儿孕妇和88例产前诊断为DS胎儿的孕妇作为研究对象，以探讨母血清AFP-L2和AFP-L3与DS胎儿的相关性，并比较AFP-L2和AFPL3代替AFP后，联合free β-HCG并建立不同建模联合DS筛查效能情况。

图2 AFP-L2、AFP-L3等多项指标联合筛查DS的ROC曲线

本研究结果显示，DS胎儿的孕妇血清AFP-L2、AFP-L3水平均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。俞菁等[10]研究结果表明DS孕妇血清AFPL2%高于健康孕妇，差异有统计学意义（P＜0.05）。龙峰等[18]研究结果示DS孕妇血清中AFP-L3%高于正常孕妇，差异有统计学意义（P＜0.05），上述研究结果与本研究结果一致，但Huai等[19]研究结果表明孕有DS胎儿孕妇血清AFP-L3中位数为0.46，显著低于1在正常对照组（P＜0.05），与本研究结果不同，可能与采用AFP-L3评价方式不同有关。

本研究AFP-L2筛查DS胎儿的AUC=0.891（95%CI：0.841～0.941），P＜0.01。AFP-L3 筛查 DS 胎儿 AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。远高于 AFP 的AUC=0.509（95%CI：0.414～0.603）。龙峰等[18]AFP-L3%的AUC=0.710，结果显示以AFP-L3%≥10%为界限时，可以很好地区分DS孕妇和正常孕妇。Yamamoto等[9]AFP、AFP-L3%、AFP-L3和 AFP-L3/AFP的 AUC=0.750、0.868、0.949和0.946。AFP-L3和AFP-L3/AFP的AUC显著高于 AFP-L3%（P＜0.05）和 AFP（P＜0.05），与本研究结果相近。根据ROC曲线计算出AFP-L2、AFP-L3筛查DS胎儿的最佳临界值分别为：6.24ng/ml、1.75ng/ml时，其灵敏度、特异度、约登指数分别为：0.721、1.000、0.721；0.663、0.967、0.627。均高于 AFP 的 0.525、0.558、0.083。

Huai等[19]研究结果表明使用1/270为临界值时，如果AFP-L3替代 AFP对三联筛查（AFP、HCG、uE3）检测的灵敏度从74%提高到81%，假阳性率从5.4%到6.8%略有增加。同样，如果采用四联筛查（AFP、HCG、uE3，抑制素A）检测，AFP-L3取代AFP后，其灵敏度从81%提高到89%，假阳性率从4.6%到5.6%略有增加。在中孕期DS筛查中AFP-L3替代AFP在稍高的假阳性率为代价时，具有更高的灵敏度。Yamamoto等[20]研究结果表明母体血清中AFP-L3%能有效区分是否孕有DS患儿。在假阳性率5%时，孕妇血清AFP-L3%可发现55%的DS患儿。在产前DS筛查上AFP-L3可以有效替代AFP。本研究也是以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并与free β-HCG建立不同模型分析后结果显示，以AFPL2+AFP-L3+free β-HCG筛查DS胎儿的AUC最高=0.929（95%CI：0.861～0.975）。最佳临界值为 1/1 636 时灵敏度、特异度、约登指数分别为：0.907、0.857、0.764，不同模型联合筛查DS的效能高低顺序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFP-L2+free β-HCG＞AFPL3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG。

目前AFP-L2、AFP-L3作为科研试剂成本为每人次100元左右，相比传统AFP试剂成本略高，如果以后能推广为常规检测，则试剂成本应该与AFP相近。

综上所述，中孕期母血清AFP-L2和AFP-L3筛查DS胎儿具有较高的灵敏度和特异度，可替代AFP筛查DS，并以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG联合筛查效能最高。