毛蕊花苷对高原缺氧小鼠记忆损伤的改善及机制研究

朱玉婷，王谨慧，李茂星, ，李晓琳,，陶文迪，刘延彤

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州总医院全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃 兰州730050；3.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 7350000；4.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

随着越来越多的人进入高原地区生活、工作，高原上的低压缺氧环境作为一种损伤和致病因素逐渐凸显出来。缺氧可激发机体产生应激反应，引起高山病、肺水肿、脑水肿、感觉及运动功能障碍等一系列急慢性疾病[1-2]，导致记忆损伤，作业效能下降。

毛蕊花苷(图1)是一种广泛分布于苁蓉、马先蒿、螃蟹甲等多种双子叶植物的苯乙醇苷类化合物，又称类叶升麻苷、麦角甾苷。研究发现，毛蕊花苷具有显著的抗氧化[3]、抗菌抗炎[4-5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、增强记忆力[8]等生理活性。课题组前期研究表明，从藏药马先蒿中提取得到的苯乙醇苷富含毛蕊花苷，具有明显的高原缺氧记忆损伤保护作用[9]。本实验采用毛蕊花苷干预高原缺氧时小鼠八臂迷宫实验，从氧化应激方面探究其对高原记忆的改善作用，阐明其可能的机制。

图1 毛蕊花苷结构式

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性BALB/C小鼠90只，体重(20±2)g，兰州总医院动物实验科提供，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2012-0020，使用许可证号：SYXK(军)2012-0029。饲养室温度为(25±2)℃，每12 h明暗交替，维持饲料喂养，自由进水。为了保证小鼠能健康生长并顺利实验，进行八臂迷宫训练过程中限制其饮食，使体重维持在自由进食的80%～85%。

1.2 药品与试剂

毛蕊花苷为实验室自制(HPLC法测定含量，以毛蕊花糖苷计为81.39%)；总蛋白定量试剂盒(BCA法，批号：20170726)、活性氧(ROS)测试盒(批号：20170724)、微量还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒(批号：20170724)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒(批号：20170724)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20170726)，均由南京建成生物工程研究所生产。

1.3 实验器材

RM-200八臂迷宫分析测试系统(成都泰盟科技有限公司)；DYC-3070 大型低压氧仓(贵州风雷航空军械有限公司)；BP210S电子天平(赛多利斯有限公司)；全自动样品快速研磨仪JXFSTPRP-24(上海净信科技)；Sigma 3K15低温离心机(德国Sigma公司)。

2 方法

2.1 八臂迷宫训练

八臂迷宫实验开始前先让小鼠在迷宫内适应环境，2次/d，一次3～4只。适应环境时在每臂都放置食物，小鼠自由摄取食物180 s。开始训练后，只在迷宫的4个臂放置食物(1、2、4、6臂)，并贴信号图片，维持此顺序至实验结束。起初先将小鼠置于迷宫中央区的透明舱内， 15 s后撤除透明舱，让小鼠自由觅食，待180 s末或动物完成所有放食臂的觅食时作为一次训练结束。检测的指标为：①工作记忆错误(working memory errors，WME)：小鼠在同一次训练中第二次或多次进入已经吃过食物的臂；②参考记忆错误(reference memory errors, RME)：小鼠进入无食物臂；③错误总数(total errors，TE)：180 s内的错误总数；④潜伏期(total reaction times，TT)：小鼠完成一次训练所用时间。当连续5次TE≤1，同时WME=0则可视为训练成功(连续训练25 d)。

2.2 动物分组及给药方式

从训练成功的小鼠中挑选出50只随机分为5组(常氧对照组，缺氧模型组，毛蕊花苷低、中、高剂量组)，每组10只。自分组起，毛蕊花苷低、中、高剂量组分别给予50、 150、300 mg/kg药物灌胃，常氧对照组和缺氧模型组给予等体积的蒸馏水(0.1 ml/10 g)灌胃，连续7 d，1次/d。

2.3 高原低压低氧模型的制备

给药第4 天，用八臂迷宫测试系统测试各组小鼠的WME、RME、TE及TT，每只测试2次，取平均值。测试后，常氧对照组置于饲养室(海拔约1 500 m)，剩余各组置于大型低压氧舱中，模拟海拔7 500 m 高原环境(舱内压力：35.9 kPa，氧分压：8.0 kPa)，每天上午9点以2 m/s匀速下降至4 000 m(舱内压力：62.1 kPa，氧分压：13.0 kPa)，实验员进入在舱内灌胃给药并加水补食，连续3 d。给药结束后，将低压氧舱以2 m/s匀速上升至7 500 m，在氧舱中的小鼠可自由饮水、摄食。

2.4 八臂迷宫实验测定小鼠空间记忆能力

第7天，对5组小鼠进行八臂迷宫测试(在海拔4 000 m低压氧舱内进行)，记录各组小鼠WME、RME、TE及TT，每只测试2次，取平均值。对照前后2次测试结果，考察在高原缺氧环境下毛蕊花苷对小鼠记忆损伤的改善作用。

2.5 血浆和脑组织MDA、GSH含量、T-SOD活力、脑组织ROS含量测定

各组小鼠八臂迷宫测试完毕后，眼球取血，脱臼处死。在冰盘上剥取脑组织。BCA法测定脑组织匀浆蛋白含量，按试剂盒说明书测定血浆和脑组织的MDA、GSH含量和T-SOD活力，脑组织ROS含量。

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 毛蕊花苷对高原记忆损伤小鼠八臂迷宫测试结果的影响

与常氧对照组比较， 缺氧模型组WME、RME、TE及TT分别增加933%、294%、390%和157%(P<0.01)。与缺氧模型组比较，毛蕊花苷高剂量组WME、RME、TE及TT分别降低58.1%、59.7%、59.2%及46.3%(P<0.01)；毛蕊花苷中剂量组WME、RME、TE及TT分别降低54.8%、56.7%、56.1%及42.5%(P<0.01)；毛蕊花苷低剂量组TT降低27.6%(P<0.05)，见表 1。

表1 毛蕊花苷对小鼠八臂迷宫测试结果的影响

**P<0.01，与常氧对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与缺氧模型组比较

3.2 毛蕊花苷对小鼠血浆MDA、脑组织MDA和ROS的影响

与常氧对照组比较， 缺氧模型组小鼠血浆MDA、脑组织MDA和ROS含量分别增加74.8%、122%和92.2%(P<0.01)。与缺氧模型组比较，毛蕊花苷高剂量组小鼠血浆MDA、脑组织MDA和ROS含量分别降低31.7%、34.7%和32.8%(P<0.01)；毛蕊花苷中剂量组小鼠脑组织MDA和ROS含量分别降低30.2%和23.2%(P<0.01)，见表2。

3.3 毛蕊花苷对小鼠血浆和脑组织GSH含量、T-SOD活力的影响

与常氧对照组比较，缺氧模型组小鼠血浆和脑组织GSH含量、T-SOD活力分别降低32.4%、36.8%、18.7%和31.6%(P<0.01)。与缺氧模型组比较，毛蕊花苷高剂量组小鼠血浆和脑组织GSH含量、T-SOD活力分别升高39.0%、51.6%、20.5%及37.8%(P<0.05，P<0.01)；毛蕊花苷中剂量组小鼠血浆GSH含量、T-SOD活力和脑组织GSH含量分别升高34.5%、16.4%及48.3%(P<0.05，P<0.01)，见表 3。

表2 毛蕊花苷对小鼠血浆MDA、脑组织MDA和ROS的影响

**P<0.01，与常氧对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与缺氧模型组比较

表3 毛蕊花苷对小鼠血浆和脑组织GSH含量、T-SOD活力的影响

*P<0.05，**P<0.01，与常氧对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与缺氧模型组比较

4 讨论

学习记忆的能力直接反映了大脑作为高级中枢对其他组织器官信息的整合能力。高原缺氧使得进入该环境的人产生不同程度的脑损伤，导致记忆功能障碍，作业效能下降。研究发现，高原低压低氧暴露能改变人的睡眠模式，增加觉醒次数；使人变得压抑、焦躁；分散注意力，降低记忆力和执行力[10]。

本实验中，八臂迷宫测试结果显示，缺氧模型组小鼠的WME、RME、TE和TT与常氧对照组相比明显升高，表明高原缺氧的确造成了动物的记忆损伤。给予毛蕊花苷干预后，各组WME、RME、TE和TT相比于缺氧模型组则有显著降低，表明毛蕊花苷确实对高原缺氧记忆损伤有改善作用。

高原缺氧环境可激发机体氧化应激反应，组织中的氧自由基和氮自由基生成增多，进一步造成器官损伤。脑组织(特别是大脑皮质、海马和纹状体)抗氧化系统非常薄弱，对氧异常敏感。本实验通过对血浆和脑组织MDA、GSH含量、T-SOD活力和脑组织ROS含量进行测定，结果表明氧化应激可能是引起神经元损伤的重要因素之一。相比而言，毛蕊花苷干预后，血浆和脑组织中的ROS、MDA含量显著降低，GSH含量、T-SOD活力明显升高，提示毛蕊花苷对高原缺氧小鼠记忆损伤的改善作用可能是通过稳定机体抗氧化酶系统的平衡，减轻氧化应激来实现的。

本实验选择毛蕊花苷低(50 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)3个剂量组灌胃给药，考察毛蕊花苷对小鼠高原缺氧记忆损伤改善作用的量-效关系。结果显示，低剂量组八臂迷宫测试和氧化应激指标大多与缺氧模型组无统计学差异，可能是因为剂量未达到最小有效量。中、高剂量组的各项指标显示毛蕊花苷的确有较好的抗高原缺氧记忆损伤的效果。

综上所述，毛蕊花苷对高原缺氧记忆损伤改善作用的机制之一可能是稳定机体抗氧化酶系统的平衡、减轻氧化应激，是否还有其他机制尚待研究。