胶质母细胞瘤中内源竞争RNA网络介导的长链非编码RNAs功能研究*

李乾鹏，嵇江淮，安奕，李黎，赵磊△，李冬果△

(1.首都医科大学，北京 100069；2.首都医科大学宣武医院麻醉手术科，北京 100053；3.国家老年疾病临床研究中心，北京100053；4.郑州大学附属洛阳中心医院，洛阳 471009)

1 引 言

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是神经胶质瘤中最为恶性的一种，在所有成年脑癌患者占比达60%，尽管现今医疗技术发展迅速，对GBM仍然缺乏有效的治疗手段，患者的中位生存时间只有14至15个月[1-2]。随着研究的发展，除了编码基因，大量通过基因组而不是编码蛋白转录的非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)被鉴别出来[3]。MicroRNAs (miRNAs)和lncRNAs是ncRNAs研究的重要方向。大量的研究表明，miRNAs在转录后调控基因的表达，并参与多种生物过程和疾病[4]。最近，lncRNAs(这些长度大于200 个核苷酸且具有很少或没有蛋白质编码潜力的转录物[5])已经成为生物医学研究的热点。LncRNAs在肿瘤发生和发展中起重要作用[6]。Wang等[7]研究表明，lncRNA LEF1-AS1在GBM中显著高表达，并且敲出LEF1-AS1抑制GBM细胞的增殖和侵袭。Shi等发现lncRNA H19被证明可以促进胶质瘤中癌症的发展和侵袭[8]。尽管这些非编码RNAs在GBM的进程中发挥着重要的作用，但这些非编码RNAs特别是lncRNAs的功能尚不清楚，特别是lncRNAs生物标志物的鉴别仍具有很大的挑战性。

与此同时，随着对lncRNAs以及miRNAs等非编码RNA研究的进行，人们发现lncRNAs可以通过与miRNAs结合从而发挥RNA海绵的功能[6, 9]。最近的研究也表明，lncRNAs作为一种竞争性内源RNA，通过充当miRNAs海绵来调控其他转录物的表达水平[10-11]。Yu等[12]发现GAS5作为miR-222的ceRNA可以增加p27的表达水平，从而抑制肝脏纤维化进展。另外有研究表明lncRNA lncHERG促进GBM细胞的增值，并且lncHERG可以充当肿瘤抑制因子miR-940的竞争性内源RNA[13]。然而之前的报道主要关注在GBM中lncRNAs的鉴别，同时ceRNAs相关的几个数据库已经被开发出来用于lncRNAs功能的研究[11, 14]。这些研究结果表明表达谱和网络分析的整合可以用来识别风险的lncRNAs和潜在的治疗靶点。目前在GBM中，lncRNAs作为ceRNA网络的研究仍处于初步阶段，有效地识别GBM中风险的致病因子对研究GBM的致病机制具有重要的意义。

在本研究中，我们整合多组数据，采用一种计算策略构建GBM中lncRNAs介导的ceRNA网络。我们研究网络中lncRNAs和mRNAs的拓扑属性，选取度和中介中心性前5%的节点作为hub节点，从而进一步构建GBM中lncRNAs介导的hub-ceRNA网络。最后，我们对网络中的基因进行功能分析。我们的研究将会帮助理解癌症相关的lncRNAs介导的ceRNA网络，同时也为识别GBM风险标记物提出新的见解。

2 数据来源及方法

2.1 数据来源

GBM的表达谱数据(共计159个肿瘤样本)收集于TCGA数据库。我们从miRTarBase (Release 7.0)数据库[15]下载实验验证的mRNA-miRNA关系对。实验验证的lncRNA-miRNA关系对RAID V2.0 数据库[16]中获取。对GBM的表达谱数据进行预处理后，我们利用gencode中全基因组的注释文件(V19)[17]重新注释出lncRNA的表达谱数据和mRNA的表达谱数据。

2.2 GBM中ceRNAs关系对的鉴别

我们将从上述两个miRNA靶点数据库中下载的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA相互作用关系对进行初步的匹配，保留在mRNA和lncRNA之间共享同一个miRNA的ceRNA关系对。为了能够评估每个lncRNA和mRNA之间共享的miRNAs的显著性，我们用超几何分布来鉴别竞争性lncRNA-mRNA关系对。见式(1)，整个基因组中miRNA总数为N，其中K和M是每个lncRNA和mRNA相关的miRNAs数量，x是每个lncRNA-mRNA关系对共享的miRNAs的数量。P值用来评估竞争性lncRNA-mRNA关系对的显著性。我们用错误发现率(fdr)来矫正P值。如果矫正后的P值≤0.01，我们就认为该ceRNAS对是显著的。

(1)

为了鉴别GBM中lncRNAs介导的ceRNA对，基于匹配的lncRNA和mRNA表达谱数据，我们计算每一对显著的lncRNA-mRNA关系对的皮尔森相关系数，见式(2)，式中cov(X,Y)是变量X和Y的协方差，σX和σY分别是X和Y的标准差。我们把P值≤0.01作为阈值。

(2)

2.3 hub网络的构建和lncRNAs功能的预测

研究表明一些hub节点和瓶颈节点可能成为网络中癌症的预后因子，并且hub节点通常被定义为网络中节点的前10%～20%[18-19]。我们对构建的GBM相关的ceRNAs进行拓扑分析，研究网络中lncRNAs和mRNAs的拓扑属性，我们定义网络中度前5% 的节点为hub节点，中介中心性(betweenness centrality，BC)前5%的节点为瓶颈节点。我们取hub节点和瓶颈节点的交集作为GBM中ceRNA网络新的hub节点。这些hub节点被用来构建GBM中lncRNAs介导的hub-ceRNA网络。网络用Cytoscape(v3.6.1)软件可视化[20]。

我们用Bioconductor包“ clusterProfiler”[21]来预测lncRNAs的功能。通过Benjamini-Hochberg方法(BH)校正P值，如果矫正后的P值≤0.05，该GO项和富集通路就认为是显著的。

3 结果

为了全面的评估lncRNAs介导的ceRNAs关系对，我们采用一种策略来逐步鉴别显著的lncRNA-mRNA竞争性关系对。从数据库中收集实验验证的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA相互作用关系对。在对两类关系对进行初步匹配后，我们用超几何分布来计算每个lncRNA-mRNA对共享的miRNAs的显著性。保留显著的lncRNA-mRNA竞争性关系对用作进一步的鉴别。为了鉴别GBM中共表达的ceRNAs对，我们计算每个候选的ceRNA对的皮尔森相关系数。选取PCC>0的ceRNAs关系对，总共有25536对。其中mRNA有2439个，lncRNA有575个。见图1A，我们用这些关系对构建GBM相关的ceRNA背景网络。其中橘黄色的圆点代表lncRNA，蓝色的圆点代表mRNA，一个lncRNA-mRNA对我们用红线连接。从图中可以看出大部分的lncRNA集中在网络的中央，mRNA多分布在网络的四周。接着我们对网络中的lncRNAs和mRNAs进行拓扑分析。见图1B，发现lncRNAs的节点度和BC远远大于mRNAs的节点度和BC。因此，我们认为在GBM相关的ceRNA网络中，lncRNA的调控占据主导地位。

图1 GBM相关的ceRNA背景网络和拓扑分析Fig 1 GBM related ceRNA background network and topology analysis

为了构建GBM中lncRNAs介导的hub-ceRNA网络，选取度和BC前5%的节点作为新的hub节点。其中lncRNA有23个，mRNA有96个。我们基于之前的ceRNA关系对用这些lncRNAs和mRNAs构建hub节点的ceRNAs网络，共426对。见图2A，其中蓝色表示mRNA，橘黄色表示lncRNA，节点的大小表示节点在网络中的度。

为了研究这些hub-ceRNA 中lncRNAs的可能功能，我们显著富集的功能项去注释网络中的编码基因。图2展示了显著性靠前的GO富集项和KEGG富集项。结果显示这些hub节点的lncRNA显著富集的GO项为上皮细胞增殖(GO:0050673)，肽酰丝氨酸磷酸化(GO:0018105)，细胞周期停滞(GO:0007050)和肌细胞增殖(GO:0033002)。显著富集的通路为癌症中的miRNA(hsa05206)，内分泌抵抗(hsa01522)和乳腺癌(hsa05224)。

图2 GBM中lncRNAs介导的hub-ceRNA网络和功能富集分析Fig 2 Analysis of lncRNAs-mediated hub-ceRNA network and functional enrichment in GBM

4 讨论

近年来，ceRNA在癌症中的研究已经引起广泛的关注。最近的研究表明，人类lncRNAs被发现与mRNAs竞争结合miRNAs，从而通过间接转录后机制调控mRNAs的表达水平[22]。Yang等研究表明GBM中ceRNA相互作用网络与典型致癌途径有关[23]。

在本研究中，我们利用GBM的表达谱数据和实验验证的miRNA靶点关系对，构建GBM相关的ceRNA关系对。通常，节点的度越高表明该节点为hub节点，可以参与更多的ceRNAs相互作用。而节点的中介中心性越高表明该节点更有可能是一个瓶颈节点，可以作为连接不同网络模块的桥梁。因此，我们选取度和中介中心性前5%的节点作为新的hub节点，并用这些lncRNAs和mRNAs构建hub-ceRNA网络。Yang等[24]研究表明MCM3AP-AS1在GBM中下调，并且敲除MCM3AP-AS1可以抑制GBM的血管生成。多项实验表明敲掉AKT3基因抑制GBM细胞的侵袭[25]。在我们的hub-ceRNA网络中，也发现MCM3AP-AS1- AKT3 ceRNA对的存在。因此，我们推断MCM3AP-AS1- AKT3 ceRNA对可能是GBM治疗的潜在靶点。同时，我们通过利用GeneCards数据库[26]筛选hub-ceRNA网络中的lncRNAs，还发现其中CASC2和NPHP3-AS1两个lncRNA与星形细胞瘤有关。

为了进一步分析这些lncRNAs的功能，我们对在hub-ceRNA网络图中与lncRNAs共表达的基因做功能富集分析。研究结果发现在显著富集的GO项中，有多个GO项与细胞的增殖有关，另外还发现了与胶质生成(GO:0042063)有关的GO项。并且这些GO项都是显著性排名靠前的GO项。研究结果进一步表明，在我们的hub-ceRNA网络中的这些lncRNAs和mRNAs可能是GBM相关的靶点基因。但是目前对GBM中lncRNAs功能的研究认识尚浅，我们将进一步探索与GBM相关的ceRNAs对，为GBM诊断预后提供更加准确的治疗靶点。