解磷菌发酵及溶磷条件的研究

韩蕾 杨乐 唐金铭 张雅倩

（石河子大学农学院，石河子 832000）

磷是除氮外限制植物生长的主要营养元素，在能量代谢、光合作用、营养物质转运和遗传特性中起着至关重要的作用［1-2］。土壤是植物吸收磷的主要库源，但绝大部分以 Ca3（PO4）2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等难溶性磷存在，难以被植物吸收利用［3］。我国约74%的耕地土壤缺磷，农业生产主要以施用化学磷肥供给有效磷，而施入土壤的磷肥除小部分被作物吸收外，75%-90%与土壤中Ca2+、Fe3+、Al3+等阳离子反应沉积在土壤中，导致土壤磷素不断积累，而有效磷缺乏，这不仅会造成有限的磷矿资源大量浪费，而且还会加剧农业面源污染问题［4-6］。根据农业部“一控两减三基本”的要求，如何有效利用土壤中固定的难溶性磷，提高磷肥的利用率，从而减少磷化肥的施用量，对解决土壤中磷的供需矛盾具有重要意义。

土壤微生物是土壤养分循环转化的动力，解磷菌能够通过分泌有机酸、无机酸、嗜铁素、H2S、腐殖质、磷酸酶及胞外多糖等物质，或NH4+同化作用将土壤中无效磷转化为植物可利用的有效磷，可提高磷肥利用率、改善土壤结构和促进作物生长［7-10］。目前已发现的解磷细菌主要有无色杆菌属、气杆菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属、沙雷菌属、黄单胞菌属、克雷伯菌属、气单胞菌属和肠杆菌属等［11-12］。然而，解磷菌施用于土壤效果受到菌株定殖竞争能力和环境条件影响，尤其是石灰性盐化土壤，其固定的难溶性磷酸盐主要以磷酸钙的形态存在，因此，需筛选适应新疆盐碱土环境的具有溶磷特性的微生物。此外，解磷菌的数量是其前期定殖和竞争的基础，新疆主要采用滴管、喷灌等方式，一般肥料随水进入作物根区，为解磷菌以发酵液形式进入土壤奠定了基础，也便于其在作物根部定殖、生长和溶磷。基于此，以盐碱土中分离纯化得到一株高效解磷菌PS-3为研究对象，采用单因素和正交试验，研究菌株PS-3的发酵条件，考察碳源、氮源、pH、温度、盐度和接种量对菌株PS-3溶解磷酸三钙的影响，为新疆盐碱土磷素的有效性释放和合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：PS-3为本实验室从新疆盐碱土中筛选获得。

LB培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

国际植物研究所磷酸盐生长培养基（National Botanical Research Institute’s phosphate growth medium，NBRIP）［13］：葡萄糖 10 g，Ca3（PO）25 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株PS-3发酵条件的研究 将菌株PS-3接入LB培养基中培养22 h，以1%的接种量投加至新鲜LB培养基，分别调节体系的温度（15-45℃）、初始pH（4-10）和盐浓度（0-7%），同时以不接菌的LB培养基为对照，每个处理重复3次，分别置于120 r/min振荡培养，测定发酵液的OD600。

1.2.2 菌株PS-3溶磷条件的优化

1.2.2.1 碳源和氮源的影响 分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖为NBRIP中唯一碳源（1%），其他培养基成分不变，按2%的接种量接种菌株PS-3，于35℃，120 r/min振荡培养3 d，以不接菌的为对照，每个处理重复3次，10 000 r/min离心10 min取上清液，采用钼锑抗比色法［14］测定有效磷含量，筛选出最适碳源后进行浓度优化（0.5%-5%）。在此基础上，以硝酸钠、尿素、硝酸铵及氯化铵为氮源等量替换硫酸铵，研究不同氮源对菌株PS-3溶磷的影响，并优化氮源添加量（0.005%-0.05%）。

1.2.2.2 环境因素对菌株PS-3溶磷的影响 将发酵培养22 h的菌株PS-3制成菌悬液，按2%的接种量投加至优化的NBRIP中，分别调节体系的温度（20、25、30、35和 40℃）、初始 pH（5、6、7、8和 9）和盐浓度（2 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、30 g/L和50 g/L），在120 r/min培养7 d，同时以不接菌的为对照，每个处理3次重复，以钼锑抗比色法测定有效磷含量。

1.2.2.3 正交试验 采用L16（44）设计正交试验进一步优化菌株PS-3的溶磷能力，以不接菌的为对照，每个处理重复3次，试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS19.0进行统计分析和显著性检验。

2 结果

2.1 菌株PS-3发酵条件的研究

通过摇瓶发酵试验，考察温度、pH和盐浓度对菌株生长的影响，结果见图1。由图1-A可知，随着温度的升高，菌株PS-3的OD600值呈现先增加后降低的现象，在15-45℃范围内均能生长，35℃为最适生长温度，而当温度低于25℃或高于40℃时，菌株生长缓慢，数量显著下降（P＜0.05），这可能是由于环境温度过高时，会使微生物蛋白质失活死亡，而温度较低时，酶的活性降低，影响微生物的生长繁殖。菌株PS-3对酸碱的耐受性较好，在pH值5.0-9.0的范围内均能生长，最适pH值为7，而当pH低于6或高于8时，菌株PS-3的生长才会受到明显抑制（图1-B）。

渗透压会影响微生物的生长，结果见图1-C。随着NaCl浓度增加，菌株PS-3的OD600值呈现先升高后降低的趋势，且差异显著（P＜0.05）。菌株PS-3最适生长盐浓度为1%，在盐浓度为0-5%范围内均能生长，这可能与菌株PS-3从盐碱土中分离有关，而当盐浓度达到7%时基本不能生长。综上所述，菌株PS-3的较适发酵条件为温度35℃、pH 7、盐浓度1%。

2.2 菌株PS-3溶磷条件的优化

2.2.1 碳源对菌株PS-3溶磷的影响 碳源对菌株PS-3溶磷效果的影响，结果见图2。由图可知，不同碳源对菌株PS-3溶解磷酸三钙的能力有差异，溶液中有效磷含量大小依次为葡萄糖＞麦芽糖＞果糖＞蔗糖＞乳糖。以葡萄糖和麦芽糖为碳源时，溶液中有效磷含量在470 mg/L以上，显著高于果糖、蔗糖、乳糖（P＜0.05），其中，葡萄糖为碳源时，菌株PS-3溶磷能力最强，溶液中有效磷含量可达539.19 mg/L，而当碳源为乳糖时，菌株PS-3溶磷效果最差，有效磷含量仅仅为20.50 mg/L，可能是由于乳糖的代谢途径更为复杂，菌株PS-3不能很好地利用乳糖。

图2 碳源对菌株PS-3溶磷的影响

在此基础上，以葡萄糖作为碳源，考察葡萄糖浓度对菌株PS-3溶磷效果的影响，结果如图3所示。由图可以看出，随着葡萄糖浓度增加，溶液中有效磷浓度呈现先增加后降低的趋势，且差异显著（P＜0.05），菌株PS-3溶磷最适的葡萄糖浓度为2%。2.2.2 氮源对菌株PS-3溶磷的影响 由图4可看出，菌株PS-3以硝酸铵为氮源时，有效磷含量为706.67 mg/L；以氯化铵、硫酸铵和硝酸钠为氮源时，有效磷含量均超过648 mg/L，但无显著差异（P＞0.05）；以尿素为氮源时，有效磷含量最低；菌株PS-3对氮源的利用顺序依次为硝酸铵＞硝酸钠＞氯化铵＞硫酸铵＞尿素，这表明该菌株以硝态氮为氮源时较铵态氮对磷有更好的溶解能力，这可能与菌株PS-3代谢途径有关。

图3 葡萄糖浓度对菌株PS-3溶磷的影响

图4 氮源对菌株PS-3溶磷的影响

图5 硝酸铵浓度对菌株PS-3溶磷的影响

在优化碳、氮源的基础上，考察硝酸铵浓度对菌株PS-3溶磷效果的影响，结果见图5。由图可知，随着硝酸铵浓度增加，溶液中有效磷含量呈现先增加后降低的趋势，当其浓度达到0.01%时，溶液中有效磷含量最高，而硝酸铵继续增加时，溶液中有效磷含量开始下降，且差异不显著（P＞0.05）。

2.2.3 温度对菌株PS-3溶磷的影响 由图6可以看出，温度对菌株PS-3溶解磷酸三钙的影响不明显，在20-40℃范围内均具有良好的溶磷能力，当温度从20℃上升至35℃时，菌株PS-3对磷的溶解能力增加了11.86%，在温度达到35℃后，菌株PS-3溶磷能力逐渐降低，但差异不显著（P＞0.05），这表明菌株PS-3具有一定的耐温性。

图6 温度对菌株PS-3溶磷的影响

2.2.4 初始pH对菌株PS-3溶磷的影响 由图7可知，菌株PS-3在pH 5-9的范围内均能溶解磷酸三钙，具有较强的适应能力，尤其是在pH值6-8的环境中，溶液中有效磷含量均超过750 mg/L；而pH高于8时，溶液中有效磷含量显著降低（P＜0.05），可能是由于体系中碱性较强，溶磷菌分泌的有机酸量有限，影响了溶磷效果。

图7 初始pH值对菌株PS-3溶磷的影响

2.2.5 盐浓度对菌株PS-3溶磷的影响 随着盐浓度上升，溶液中有效磷含量呈现先增加后降低的趋势（图8）。菌株PS-3在NaCl浓度为0-5%范围内均能溶磷，盐浓度为0.2%时，溶磷量达到最高，含盐量在2%以内基本不影响菌株的溶磷能力，能够适应新疆盐渍化土壤环境；而盐浓度超过3%时，溶液中有效磷含量显著下降（P＜0.05），菌株PS-3溶磷能力受到了明显的抑制。

图8 盐浓度对菌株PS-3溶磷的影响

2.2.6 正交试验 对菌株PS-3进行4因素4水平正交试验，结果见表2。由K值和极差R大小可知，4个因素对菌株PS-3溶磷效果的影响主次顺序为盐浓度＞接种量＞ pH＞温度。正交试验初步得到的最优溶磷条件为pH 7.5、温度35℃、盐浓度2 g/L，接种量4%。在最优溶磷条件下，验证实验结果表明该菌株在7 d的溶磷量可达100 2.95 mg/L。

3 讨论

在土壤磷循环过程中，解磷微生物起着重要的作用，它可以将土壤中的难溶性磷转化为植物能够吸收利用的有效磷，提高磷肥的利用率、改良土壤结构和提高作物产量［15-18］。解磷菌自身特性和环境因素会影响其溶磷效果。本研究中筛选的解磷菌PS-3来自于新疆盐碱地，具有一定的耐盐胁迫能力，在盐浓度为5%时仍可生长，其对磷酸三钙的溶磷量可达127.61-1 002.95 mg/L。江红梅等［19］从内蒙古盐碱地中筛选得到的解磷菌M1可耐受10% NaCl。向文良等［20］从四川盐井分离的中度嗜盐菌QW1011可在15% NaCl中生长，其溶磷能力可达56.76-71.34 mg/L。胡山等［21］从河西走廊盐碱地分离的解磷菌Y3-35也具有一定的耐盐性，在盐浓度为0.25%时溶磷量可高达723.34 mg/L，这说明了盐碱土中的解磷微生物具有一定的耐盐能力。与上述耐盐解磷菌相比，本研究中的菌株PS-3具有较强的溶磷能力。

表2 L16（44）正交试验结果

研究表明，培养基中碳氮源会影响解磷菌的生长，并通过改变其产生的有机酸类型和浓度影响溶磷效果［22-23］。卫星［24］等研究发现，以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源时，巨大芽孢杆菌NCT-2的溶磷量可达93.34 mg/L；黄达明等［25］的洋葱伯克霍尔德氏菌P0417以葡萄糖、草酸铵为碳氮源时，其溶磷量可达791.84 mg/L；Jain等［23］分离的溶磷菌S29优先利用乳糖和硫酸铵，其对磷酸三钙的溶解量高达1 110 mg/L。本研究中的菌株PS-3在不同碳氮源条件下的溶磷量也存在差异，当葡萄糖为碳源、硝酸铵为氮源时，该菌株 7 d优化的溶磷量可达到1 002.95 mg/L，这与李海云等［26］的研究结果一致。从新疆盐碱土中分离出具有一定耐盐解磷能力的菌株，这为新疆盐碱土磷素的有效性释放和合理利用提供理论依据，对区域农业的可持续发展具有重要意义。后续研究中，将对解磷菌PS-3的解磷机理及其在土壤中的定殖能力、溶磷效果等方面做进一步研究。

4 结论

菌株PS-3具有一定的耐酸碱、温度和盐度能力，在pH 5-9、15-45℃、NaCl浓度0-5%范围内均可生长。菌株PS-3的较适发酵条件为温度35℃、pH 7，盐浓度1%。

不同碳源和氮源会影响菌株PS-3的溶磷效果，其对碳源的利用顺序依次为葡萄糖＞麦芽糖＞果糖＞蔗糖＞乳糖，对氮源的利用顺序依次为硝酸铵＞硝酸钠＞氯化铵＞硫酸铵＞尿素。菌株PS-3在pH 5-9，20-40℃，NaCl浓度0-5%范围内对磷酸三钙有一定的溶解能力。

通过单因素和正交试验对菌株PS-3的溶磷条件进行了优化，获得最适条件为2%葡萄糖、0.01%硝酸铵、温度35℃、初始pH 7.5、盐浓度2 g/L、接种量4%，在此条件下，其对磷酸三钙的溶解量可达1 002.95 mg/L。