miRNA-1271对人乳腺癌细胞增殖的影响

张红晨 顾锡冬 谢小红

乳腺癌发病率居女性癌症的首位，且发病人群有年轻化趋势[1]。手术、放疗、化疗、内分泌治疗及靶向治疗是乳腺癌的主要治疗方式，若复发、转移或产生耐药，患者预后往往较差[2]。微小RNA（miRNA）是一类长度约22nt的非编码单链RNA小分子，通过在转录或转录后水平对其靶基因的表达进行调控，进而参与细胞分化、增殖和凋亡[3]。相关文献表明，miRNA在肿瘤发生、发展及变异过程中发挥着重要的调控作用[4]。本研究对miRNA-1271在乳腺癌组织中的表达以及对人乳腺癌细胞增殖的影响作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231来源于中国科学院上海生命科学研究院；SPF级健康雌性裸鼠（4～6周）购于中国科学院上海实验动物中心，体重（20.0±3.0）g。改良杜氏伊格尔（DMEM）培养基购于美国Gibico公司；FBS购自杭州四季青生物技术有限公司；转染过程中使用的LipofectamineTM2000试剂盒及Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；miRNA检测试剂盒购于德国Qiagen公司；凋亡检测试剂盒及结晶紫染液均购于美国Sigma公司。CCK-8试剂盒购于美国BD Biosciences公司。80例乳腺癌组织及其癌旁正常组织标本来源于本院2017年1月至2018年1月经术后病理学证实的原发性乳腺癌患者，所有患者术前未接受过放化疗，年龄 28～75（39，66）岁，均签署知情同意书。

1.2 RT-PCR法检测乳腺癌组织及癌旁正常组织miRNA-1271表达 将乳腺癌及癌旁正常组织标本制备成匀浆，离心除去碎片物质，取上清液，加入裂解液1ml，依次用氯仿、异丙醇抽提，乙醇洗涤，通过紫外分光光度计检测样品中RNA浓度。miRNA-1271引物为5′-CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA-3′。 以 95℃ 5min、95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s共 40 个循环进行 RT-PCR检测。miRNA反转录反应后，利用TaqMan miRNA检测并量化miRNA-1271在乳腺癌及癌旁正常组织中的相对表达量。

1.3 细胞培养及转染 将人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231分别置于添加10%FBS的DMEM培养基中，在37℃恒温、5%CO2培养箱内培养。在细胞对数生长期，使用乙二胺四乙酸消化。为研究miRNA-1271对乳腺癌细胞增殖能力的影响，笔者对MCF-7和MDA-MB-231细胞进行质粒转染，以增加miRNA-1271的表达。转染前取培养好的细胞接种于6孔培养板，转染时将培养液更换为无血清无双抗的培养液，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将miRNA-1271模拟物或阴性对照（空载质粒）与脂质体试剂混匀，室温静置20min，转染后6～8h，更换为正常的完全培养基。RT-PCR法检测实验组及对照组miRNA-1271相对表达量。转染miRNA-1271模拟物质粒的乳腺癌细胞为实验组；转染空载质粒的乳腺癌细胞为对照组。

1.4 miRNA-1271对乳腺癌细胞体外增殖的影响 采用CCK-8实验。收集稳定转染后的MCF-7和MDAMB-231细胞，分别制成单细胞悬液并在显微镜下计数。在96孔培养板中每孔接种细胞1×103个，每孔加入培养液100μl，复孔数设置为6个。连续4d在固定时间点每孔加入CCK-8试剂10μl，摇匀后避光培养3h。利用多功能酶标仪检测（波长490nm处）测定吸光度（OD）值，并绘制细胞生长曲线。

1.5 miRNA-1271对乳腺癌细胞克隆形成的影响 采用集落形成实验。细胞转染24h后，用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。细胞计数后铺于6孔板中，细胞密度为300个/孔。每组设3个复孔，反复吹打并摇匀，防止细胞成团。培养2周后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，在显微镜下计数并分析集落形成数。

1.6 miRNA-1271对乳腺癌细胞凋亡的影响 采用流式细胞术。取稳定转染24h后实验组和对照组乳腺癌细胞，冰PBS洗涤，冰乙醇固定细胞，4℃过夜。离心5min后收集细胞，加入5μl异硫氰酸荧光素并轻轻混匀，3min后再加入10μl碘化丙啶，37℃水箱中避光反应15min；离心后重悬于0.5ml预冷的缓冲液中，混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 miRNA-1271对MCF-7乳腺癌细胞体内增殖的影响 采用动物实验。取实验组（稳定过表达miRNA-1271）和对照组MCF-7细胞，分别配置成1×107个/ml细胞悬液，接种于裸鼠右腋皮下。在无病原体环境下饲养裸鼠。细胞接种4周后，处死小鼠，取出移植瘤组织并称重。

1.8 统计学处理 应用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料用 表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁正常组织中miRNA-1271相对表达量比较 乳腺癌组织中miRNA-1271相对表达量为0.55±0.02，明显低于癌旁正常组织中的1.50±0.03，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 乳腺癌组织与癌旁正常组织中miRNA-1271相对表达量比较（*P＜0.05）

2.2 miRNA-1271对乳腺癌细胞体外增殖的影响 与对照组比较，实验组MCF-7和MDA-MB-231细胞中miRNA-1271相对表达量均明显升高（均P＜0.05），即转染成功，见图2。与对照组比较，上调miRNA-1271表达后的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞OD值明显低于对照组（均P＜0.05），见图3。这表明上调miRNA-1271表达后，MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外增殖能力受到明显抑制。

2.3 miRNA-1271对乳腺癌细胞克隆形成的影响 与对照组比较，miRNA-1271过表达后的 MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞形成克隆体积更小、数目更少，实验组与对照组集落形成数比较差异有统计学意义（均P＜0.05），见图4。这表明miRNA-1271能抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的克隆形成能力。

图2 乳腺癌细胞中miRNA-1271的转染效率（a：MCF-7细胞；b：MDA-MB-231细胞；与对照组比较，*P＜0.05）

图3 miRNA-1271对乳腺癌细胞体外增殖的影响（a：MCF-7细胞；b：MDA-MB-231细胞；与对照组比较，*P＜0.05）

2.4 miRNA-1271对乳腺癌细胞凋亡的影响 与对照组比较，转染miRNA-1271的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡率明显升高（均P＜0.05），见图5。这表明miRNA-1271能促进MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡。

图4 miRNA-1271对乳腺癌细胞克隆形成的影响（a：MCF-7细胞；b：MDA-MB-231细胞；与对照组比较，*P＜0.05）

图5 miRNA-1271对乳腺癌细胞凋亡的影响（a：MCF-7细胞；b：MDA-MB-231细胞；与对照组比较，*P＜0.05）

2.5 miRNA-1271对MCF-7乳腺癌细胞体内增殖的影响 与对照组比较，实验组裸鼠移植瘤体积明显较小，质量明显较低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。这表明上调miRNA-1271表达后，MCF-7乳腺癌细胞的体内增殖能力受到明显抑制。

图6 miRNA-1271对乳腺癌细胞体内增殖的影响（a：两组移植瘤体积比较；b：两组移植瘤质量比较，*P＜0.05）

3 讨论

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌发病率及病死率均居首位，严重威胁着女性健康[5]。miRNA是一组进化保守且具有调控功能的非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区互补配对结合，导致miRNA降解或抑制其翻译表达[6]。许多miRNA发挥着类似于癌基因或抑癌基因的作用，是肿瘤的潜在治疗靶点和预后指标[7]。miRNA-1271是在人类胚胎干细胞中的ARL10基因第2内含子区域被识别，是miRNA-96的同源类似物[8]。最近研究发现，miRNA-1271 在肝癌[9]、肺癌[10]、结肠癌[11]、前列腺癌[12]和胃癌[13]中均呈低表达。在肺癌中，miRNA-1271表达降低；外源性上调其表达后，miRNA-1271通过调控mTOR基因可抑制癌细胞的增殖[10]。在胃癌中，miRNA-1271因甲基化而表达降低，通过靶向调控MEK1/ERK/MAPK信号转导途径在胃癌细胞生长、侵袭和迁移过程中发挥着重要作用[13]。然而，miRNA-1271在乳腺癌中的研究报道尚少，其生物学功能尚待阐明。

本研究对80例乳腺癌及癌旁正常组织中miRNA-1271表达进行检测，结果发现miRNA-1271在乳腺癌组织中呈低表达，说明miRNA-1271可能在乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。于是，笔者对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞稳定转染miRNA-1271模拟物，以探究上调miRNA-1271对乳腺癌细胞生物学功能的影响。CCK-8实验结果发现，miRNA-1271的表达水平升高后，乳腺癌细胞的体外增殖能力受到明显抑制；集落形成实验发现，miRNA-1271能明显减弱肿瘤细胞的成瘤能力。裸鼠成瘤实验结果证实，miRNA-1271在体内亦能抑制乳腺癌细胞的增殖。细胞凋亡，即细胞的程序性死亡，是由基因控制的细胞自主的有序的死亡[14]。凋亡是多基因多步骤严格控制的过程，而凋亡调控的失衡是肿瘤发生、发展的重要过程。本实验利用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果发现miRNA-1271能通过促进凋亡的发生来抑制乳腺癌细胞的增殖能力。Qin等[15]实验结果与之相似，在肝癌中低表达的miRNA-1271，通过靶向作用于FOXQ1基因，促进肝癌细胞凋亡比例增加，从而抑制肝癌细胞的增殖。关于乳腺癌的研究发现，FOXQ1是TGF-β信号通路中的一个重要靶点，miRNA-1271促进乳腺癌细胞凋亡的机制可能与FOXQ1相关[16]。Du等[17]近期研究发现，miRNA-1271在乳腺癌组织及细胞中的表达明显降低，并通过靶向调控SPIN1基因表达来抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，呈现出抑癌基因的活性。

综上所述，miRNA-1271在乳腺癌组织中低表达；上调miRNA-1271表达，能抑制乳腺癌细胞的增殖，促进凋亡的发生，具有抑癌作用。本研究为乳腺癌的治疗提供了一个新思路，为后续深入探讨miRNA-1271在乳腺癌中的作用机制提供了前期实验基础。