老年晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变情况研究

盛建辉 黄玉林 田明庆 姜建洋

作者单位：1浙江省衢州市人民医院呼吸内科（衢州 324000）；2浙江省衢州市柯城区人民医院内分泌科（衢州 324000）

肺癌是我国目前发病率与病死率均高居首位的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancers，NSCLC）约占80%，大部分患者初诊时已处于晚期阶段，半数以上患者年龄＞65岁，近1/3患者年龄＞75岁[1]。肺癌的化疗疗效已进入平台期，且毒副反应严重，老年患者耐受性差[2]。近年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为主要靶点的治疗是目前肿瘤研究的热点，针对EGFR突变的检测，是筛选最合适的NSCLC患者进行靶向治疗的关健[3-4]。本研究基于CT引导下经皮肺穿刺活检标本，通过直接测序法检测老年晚期NSCLC患者的EGFR基因突变类型，统计分析EGFR基因各种外显子的突变情况，为晚期非小细胞肺癌老年患者行靶向治疗提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2015年10月—2017年10月浙江大学衢州医院呼吸内科经CT引导下经皮肺穿刺活检，且病理诊断[5]为非小细胞肺癌的晚期老年患者45例，均未进行过放化疗。

1.2 方法

1.2.1 标本获取 采用SIEMENS16排螺旋CT引导下经皮肺穿刺，经Doctor Japan Co.Ltd组合式活检针常规取材两份，将其中一份送检病理科确诊为NSCLC后，再将另外一份进行DNA提取。

1.2.2 DNA提取 将取到的标本进行切片处理，制成6个切片，用石蜡进行包埋，烘干，用二甲苯去除石蜡，浸泡于无水乙醇中，取出后用超纯水冲洗，最后将组织干燥，应用Sigma-Aldrich公司DNA提取试剂盒（批号20150603）按照说明书进行DNA提取，并用安捷伦公司的Cary60紫外可见分光光度计测定提取DNA的含量和纯度。

1.2.3 EGFR基因突变检测 用ARMS-PCR法进行EGFR基因突变检测，所用仪器为北京雅康博生物科技有限公司生产的人EGFR基因突变检测试剂盒（批号TB002）和ABI实时荧光定量PCR仪，操作步骤按照基因突变检测试剂盒说明书进行，并严格按照说明书确定突变结果。每次检测均设立阳性质控、阴性质控、内参基因和内控基因。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件分析，基因突变率为该基因突变数/总标本数，基因突变率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 45例中男22例，女23例；年龄60～80岁，平均（69.80±5.37）岁；平均病程（11.5±3.7）个月；有吸烟史17例，无吸烟者28例；根据2015年世界卫生组织（WHO）肺肿瘤组织学分型[6]，鳞癌14例，腺癌31例；根据2009年IASLA国际肺癌分期[7]，Ⅲ期26例，Ⅳ期19例。

2.2 EGFR基因突变率 45例经直接测序技术测序的非小细胞肺癌EGFR基因突变的共检测出17例，总突变率为37.8%（17/45），其中11例存在外显子19、21复合突变；外显子19突变9例，占突变总数的52.9%（9/17）；外显子21突变检出7例，占41.2%（7/17），外显子19和外显子21总共占突变数的94.1%（16/17）。外显子20有1例突变，占突变总数5.9%（1/17）。

2.3 EGFR基因突变类型 EGFR基因外显子突变类型主要有错义突变、缺失突变、复制或插入突变等三种构成，见表1。

2.3.1 EGFR基因外显子19突变 外显子19突变为最常见的突变类型之一，主要发生在密码子第746～750位的碱基缺失，而导致由它们所编码的蛋白丢失。共检测出6种突变类型：类型1：del E746-A750（1）为外显子19的最常见突变类型，共检测出4例，主要由碱基序列c.2234至2249共16个碱基缺失，从而导致由密码子第746～750位所编码EGFR蛋白所需的氨基酸（ELREA）丢失。类型2：del E746-A750（2）所缺失的15个碱基主要发生在碱基序列c.2235至c.2249，但由密码子编码的氨基酸丢失与类型 1 相同。类型 3：del E746-A750（3）所缺失的 15 个碱基较类型3后移一位，但由此碱基丢失引起的氨基酸丢失与类型1相同。类型4：del E746-A751所缺失16个碱基发生在碱基序列c.2236至c.2251，相应的密码子第746～751位所编码的氨基酸（ELREAT）丢失。类型 5：del L747-P753ins S 所缺失的18个碱基序列发生在碱基序列c.2240至c.2257，从而导致密码子第 747～753位所编码的氨基酸（LREATSP）丢失，同时由密码子753所编码的脯氨酸（Pro）由新引入的丝氨酸（Ser）所替代。类型 6：del E746-A750ins P所缺失9个碱基发生在碱基序列c.2236到c.2244，从而导致由它们所编码的氨基酸（ELR）丢失。同时，碱基序列c.2248G突变成C，密码子GCA被CCA取代，相应编码的丙氨酸（Ala）错义为脯氨酸（Pro）。

表1 45例老年晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变类型

2.3.2 EGFR基因外显子20突变 EGFR基因外显子20突变，即S768I是由碱基序列c.2303G突变为T，第768位密码子AGC转变成ATC，由它所编码的丝氨酸（Ser）被异亮氨酸（Ile）替代。

2.3.3 EGFR基因外显子21突变 外显子21突变是EGFR基因突变的主要类型之一，均由碱基点错义突变引起，共检测出3种突变类型，详述如下：类型1：L858R突变占绝大部分，共检测出5例。突变发生在碱基序列c.2573T错义成G，而第858位的密码子CTG转变成CGG，所编码的亮氨酸（Leu）被精氨酸（Arg）替代。类型2：P848L突变发生在碱基序列c.2543C错义为T，相应的第848位密码子CCG变为CTG，而由密码子所编码的脯氨酸（Pro）替代成亮氨酸（Leu）。类型3：L861Q突变是发生在碱基序列c.2582T错义为A，以致第861位密码子由CTG转变为CAG，相应编码的亮氨酸（Leu）被谷氨酰胺（Gln）所替代。

2.4 EGFR突变与性别、吸烟情况、病理类型及肺癌分期之间的关系 45例老年晚期非小细胞肺癌患者中，男女两组EGFR基因突变率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。吸烟组与非吸烟组突变发生率相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。鳞癌与腺癌两种病理类型组间突变发生率相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。肺癌分期组间突变发生率相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

表2 45例老年晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体突变与性别、吸烟情况、病理类型及肺癌分期相关性

3 讨论

EGFR基因位于人类第七号常染体短臂上（7P12），由28个外显子组成，其编码的EGFR是一种将胞外信号传递至胞内的、并具有酪氨酸激酶活性重要途径的跨膜糖蛋白；调控着肿瘤组织细胞的增殖、分化、血管生成及凋亡抑制等机制，从而与恶性肿瘤的生长、侵袭，以及转移等有着密切联系[8-9]。目前，对恶性肿瘤以EGFR为主要靶点的分子靶向治疗已成为研究热点，越来越受国内外医学界所关注，而其中以肺癌靶向药小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）， 如吉 非 替 尼（Gefitinib）为代表，通过与ATP竞争结合胞内EGFR-TK结构域的ATP位点，从而抑制下游通路的信号转导，以阻断肿瘤细胞的生长[10]。EGFR-TKI药物具有高度选择性、安全性高、耐受性极好、毒副反应轻微等优点，并已在临床上较为广泛应用。

然而，EGFR-TKI类药物价格昂贵且总体疗效不高，Gefitinib对于我国人群的客观缓解率只有35.5%，而这部分患者在临床上的特征表现为女性、无吸烟史和腺癌[11]。因此，对于老年晚期非小细胞肺癌患者，不能耐受化疗情况下，选择合理的治疗对像尤为重要。Lynch等[12]和Paez等[13]学者在2004年率先报道了位于EGFR-TK基因编码区外显子18～21的突变类型与Gefitinib的有效率显著相关。Mitsudomo等[14]报道了EGFR-TKI对外显子19突变的NSCLC有效率高达81%，外显子21突变的有效率为71%，以及外显子18突变的有效率为56%，从而提示存在以上三种突变类型的NSCLC均对EGFR-TKI敏感。然而，关于外显子20突变，据有关学者研究显示，NSCLC存在TKI获得性耐药[15]。所以，EGFR基因突变，是EGFR-TKI对NSCLC敏感的强预测因子，从而临床上通过对EGFR基因突变的检测，可以筛选出最合适的患者进行分子靶向治疗，以提高EGFRTKI对NSCLC的疗效[16-17]。

研究发现，到目前为止，90%以上的EGFR基因突变集中于外显子18～21区，其中，外显子19缺失突变约占突变总数的48%，外显子21点突变占43%[14]。欧美等国NSCLC的总体突变率较低，东亚人群的突变率较高，我国EGFR基因的突变率约为34.0%，与TKI治疗NSCLC的我国总体人群的客观缓解率基本相符合，突变主要发生在外显子19与21，其检出率分别为18.5%、13.7%，而外显子20突变少见，约占1.8%[18]。

本研究显示，45例肺癌组织中，EGFR基因的总体突变率为37.8%，这与近期我国大样本研究的EGFR突变率相符合[19]。其中，外显子19和21突变占突变总数的94.1%，其突变的主要类型为外显子19的del E746-A750与外显子21的L858R，其突变类型以外显子21为主（外显子19突变占52.9%，外显子21占41.2%），与Mitsudomo等[14]报道相符合。此外，研究还发现，老年晚期NSCLC的EGFR基因突变女性（52.2%）多于男性（22.7%），非吸烟患者（46.9%）多于吸烟患者（15.4%），腺癌（48.4%）多于鳞癌（14.2%），两两之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）；而基因突变与肺癌分期无关，两者之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。根据本研究结果可知，EGFR基因突变的特点主要与性别、是否吸烟及病理类型相关，大部分突变是女性、非吸烟、腺癌患者，这与临床上经EGFR-TKI治疗有效患者的特征相吻合。

因此，对于老年晚期非小细胞肺癌，制定真正有效的个体治疗方案，选择最合适的人群是进行特异性分子靶向治疗的关健。