水蒸气蒸馏法与超临界CO2萃取法结合气相色谱-质谱分析胡椒木精油成分
2019-01-22杜丽君牛先前林晓红郑国华
杜丽君，牛先前，林晓红，郑国华
(1.漳州城市职业学院，福建 漳州 363000；2.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002；3.福建省热带作物科学研究所，福建 漳州 363001)
胡椒木(Zanthoxylumpiperitum‘Odorum’)为芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL.)植物，其全株具浓烈胡椒香味，自身少有病虫害(目前仅发现偶有炭疽病及蚜虫)，且周边植物也少有病虫害。研究发现胡椒木叶片精油中含有肉桂酸甲酯、柠檬烯、α-蒎烯、松油醇、香茅醛、β-水芹烯、α-石竹烯等多种驱虫、杀虫、杀菌成分[1]。同时，诸多研究报道，花椒属植物含有如生物碱[2-3]、类黄酮物质[4-5]、不饱和脂肪酸酰胺[6]、萜类化合物[7]等多种生理活性物质，具有抗菌抗病毒、驱虫杀虫、镇痛止痒、抑制血小板凝集、抗癌等生理药理功效[8]，在医疗保健、食品工业和日化产品[9]等领域具有巨大的应用潜力。因此，利用胡椒木次生代谢物的驱虫抗菌及诸多有利于人体的药理活性特点，研究绿色环保的植物农药来替代化学合成类农药是减少环境污染、降低生态压力、营造更利于人类健康生态环境的可行之路。
目前，有关植物驱虫抗菌活性物质的研究，较深入且具有产业发展前景的是花椒属植物，但花椒、胡椒产量的95%以上为食品原料，且受栽培技术、种植区域限制，而胡椒木具有易栽培、速生、产量高的特点，满足产业化发展的条件。本研究通过水蒸气蒸馏(SD)法和超临界CO2萃取(SC-CO2)法分别提取胡椒木叶片精油，利用GC-MS分析了其组成成分，并对比溶剂萃取法及抗氧化性检测结果，重点探讨了不同提取方法对提取成分中驱虫抗菌活性物质的影响，为胡椒木精油的分离、提取、组分研究及绿色环境友好型植物农药的开发提供科学依据。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
气相色谱/质谱联用仪(美国Varian Saturn 3900/2100)、HA 220-50-06 CO2超临界萃取装置(南通市华安超临界有限公司)、LGJ-25C冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。
胡椒木为2年生盆栽苗(株高50 cm、冠径50 cm，购自福建省福州市缤纷花木市场)，先在福建农林大学园艺学院盆栽试验场培养45 d，于9月中旬采摘生长健壮、无病虫危害的完整叶片，单蒸水冲洗，混匀、晾干后，冻干，微粉成直径小于0.46 mm的粉末，准确称取20 g用自封袋分装，置于-40 ℃冰箱中储存备用。
1.2 胡椒木精油提取方法
1.2.1水蒸气蒸馏(SD)法参照《中华人民共和国药典》[10]中挥发油的测定方法进行精油的提取，取胡椒木叶片20 g，采用正交试验优化的提取时间、NaCl浓度、料液比，以精油得率为考察值，确定最佳提取条件。
1.2.2超临界CO2萃取(SC-CO2) 取胡椒木叶片20 g，采用正交试验优化的萃取时间、萃取压力、萃取温度，以精油得率为考察值，确定最佳提取条件。
精油得率(%)=萃取精油质量/鲜样质量×100%。
1.3 GC-MS条件与测定
精油样品进样前处理：样品经干燥，石油醚(60～90°)稀释20倍后过0.22 μm有机滤膜，取1.5 mL待测。
色谱条件：采用DB-5MS色谱柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)，载气：He(99.999%)，流速1 mL/min(恒流模式)，进样量10 μL。传输线温度：280 ℃，进样口温度：250 ℃；程序升温：起始温度50 ℃，保留5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保留2 min。
质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，阱温220 ℃。在40～650 amu的质量范围内进行全扫描，记录总离子流色谱图(TIC)，以质谱鉴定各色谱峰的化学成分，峰面积归一法确定其相对含量。
1.4 抗氧化活性测定
将所得精油配制成2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL的精油乙醇溶液，备用。
DPPH·自由基清除能力测定：参考Feresin G E等[11]的方法，以同浓度的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)为对照。
还原力测定：参考邢思雷等[12]的方法，以同浓度的抗坏血酸(Vc)为对照。
1.5 统计分析
采用EXCEL、DPS 7.05版软件数据处理，SigmaPlot.v10.0软件作图。
2 结果与讨论
表1 SD法正交试验因子水平表Table 1 Factor levels of orthogonal experiment design by steam distillation
表2 SC-CO2法正交试验因子水平表
2.1 两种提取方法的正交试验优化
在单因子试验基础上，SD法选择提取时间、NaCl浓度、料液比，SC-CO2法选择萃取时间、萃取压力、萃取温度分别进行3因子3水平(33)正交试验(表1～2)，以精油得率为考察指标，分别考察2种提取方法的最佳提取条件。结果表明：SD法的最佳提取条件为提取时间4 h，NaCl浓度0%，料液比1∶6，此条件下精油得率为0.561 1%(n=3),高于正交试验方案中的最高值(0.550 1%)；SC-CO2法最佳提取条件为萃取时间为2.5 h，萃取压力为25 MPa，萃取温度为30 ℃，此时，精油得率为0.953 2%(n=3)高于正交试验方案中的最高值(0.892 8%)，表明对2种提取方法提取条件的优化是有效的。
2.2 两种提取方法的GC-MS分析与鉴定
SD法和SC-CO2法提取的胡椒木叶片精油总离子流图见图1。各色谱峰对应的质谱图经人工解析及计算机谱库检索确认。结果显示，SD法提取精油中鉴定出34种化学成分，占总成分的92.28%，包括16种烯烃、5种醇、5种酯、2种醛、1种酸、1种酮和4种其他物质。SC-CO2法提取精油中鉴定出34种化学成分，占总成分的99.77%，包括15种烯烃、5种醇、6种酯、1种醛、1种酸、1种酮和5种其他物质。详细化学成分及鉴定结果见表3。
No.Retentiontime/minCompoundMolecular formulaContent( %)SDSC-CO216.271m-Xylene(间二甲苯)C8H10<0.10.11±0.0328.506α-Pinene(α-蒎烯)C10H160.73±0.06<0.139.939β-Phellandrene(β-水芹烯)C10H160.65±0.050.1±0.02410.126β-Pinene(β-蒎烯)C10H160.25±0.031.21±0.21510.609β-Myrcene(β-月桂烯)C10H168.41±0.56-611.165α-Phellandrene(α-水芹烯)C10H160.29±0.06<0.1711.956Limonene(柠檬烯)C10H16-11.13±1.21812.166Styrene(苯乙烯)C8H843.25±7.85-912.984γ-Terpinene(γ-松油烯)C10H160.29±0.050.14±0.011013.886Terpinene(异松油烯)C10H160.67±0.070.15±0.011114.393Linalool(哩哪醇)C15H26O0.19±0.06<0.11215.146Methyl octanoate(辛酸甲酯)C9H18O20.56±0.090.20±0.011316.069Citronellal(香茅醛)C10H18O0.18±0.040.1±0.011417.2142-Cyclohexen-1-one,4-(1-methylethyl)(4-异丙基-2-环己基烯酮)C9H14O0.15±0.030.1±0.011517.546Myrtenol(桃金娘醛)C10H16O<0.1-1617.844Piperitol(薄荷醇)C10H20O0.10±0.010.12±0.011718.198Nonanoic acid-methyl ester(壬酸甲酯)C10H20O20.10±0.01<0.11818.945Linalyl acetate(乙酸芳樟酯)C12H20O2<0.10.12±0.011921.711α-Terpinene(α-松油烯)C10H160.72±0.030.30±0.012022.924Methyl cinnamate
-:not detected
2.3 两种提取方法获得精油的化学成分及相对含量差异
对比SD法与SC-CO2法提取精油的化学成分结果(表3)发现，两种提取方法中相同的化合物包括13种烯烃、5种醇、4种酯、1种醛、1种酸、1种酮和3种其他物质，共28种，其中，已被证实具有驱虫抗菌活性的物质有：α-蒎烯[13]、肉桂酸甲酯[14]可抑制多种病原菌的生长、繁殖，具良好的抗菌活性；香茅醛[15]、薄荷醇[16]对蚊虫具有较理想的趋避和击倒活性；石竹烯、α-石竹烯是驱避和毒杀蚊虫的有效成分[17]。但28种相同物质的含量均存在明显差异，如顺式肉桂酸甲酯在SC-CO2法提取液中的相对含量(73.91%)为SD法(30.33%)的2倍多；α-石竹烯在SC-CO2法提取液中含量(4.12%)为SD法(1.81%)的2倍多；β-蒎烯在SC-CO2法提取液中为1.21%，在SD法提取液中为0.25%；石竹烯在SC-CO2法提取液中为1.74%，而在SD法提取液中仅0.73%。产生差异的原因是：SD法提取精油过程中，在高温水蒸气的作用下，胡椒木精油中的β-蒎烯极可能被转化为α-蒎烯和莰烯，也会在氧气的作用下进一步被氧化为β-蒎烯氧化物和少量的桃金娘醛[18]；β-蒎烯热裂解可获得β-月桂烯[19]；松油烯可由α-蒎烯通过催化剂合成，也可由松油醇在酸作用下脱水而成[20]。本研究在SD法提取的精油中检出α-蒎烯(0.73%)、桃金娘醛(<0.01%)、β-月桂烯(8.41%)和相对含量较高的松油烯(包括α-松油烯、γ-松油烯和异松油烯)，对照SC-CO2法的检测结果可见，SD法对具有驱虫抗菌活性的物质破坏较大。
除28种相同化合物外，SC-CO2法提取液中检出大量柠檬烯(11.13%)，与溶剂萃取法提取胡椒木叶片精油[1]研究结果一致，而SD法中未检出。其原因可能与本研究中SD法的提取条件有关，柠檬烯虽可用SD法提取，但其本身是一种化学性质非常活泼的单萜，提取过程中的高温可使柠檬烯自动氧化成柠檬烯氧化物、香芹酮、香芹醇、柠檬烯二氢过氧化物等[21]一系列的氧化单环单萜。柠檬烯具有强大的抗菌活性，可抑制多种病原菌生长、繁殖[13]，其对蚊虫及其他昆虫也具有明显的驱避及毒杀活性[22-23]。SD法检出大量苯乙烯(43.25%)，SC-CO2法未检出，但检出大量顺式肉桂酸甲酯(73.91%)，可能是采用SD法提取过程中肉桂酸甲酯受热时脱羧基而生成苯乙烯。因此，从获得精油的驱虫抗菌活性而言，SC-CO2法优于SD法。
综上所述，SC-CO2法较SD法获得的胡椒木叶片精油保留了更多的驱虫抗菌活性物质，是较理想的提取方法。
2.4 抗氧化活性测定
研究表明，花椒属植物精油具有很强的清理DPPH·自由基的能力[24]。本研究中胡椒木叶片精油抗氧化活性的测定结果表明，SC-CO2法与SD法所获精油均具有清除DPPH·自由基的能力，且随着提取精油浓度的增加清除能力呈增强趋势，但SC-CO2法提取物的清除能力明显优于SD法(图2A)。SC-CO2法提取精油清除DPPH·自由基能力在8 mg/mL时达到对照BHT抑制率的97.27%，而SD获得的精油在20 mg/mL的抑制率仅为对照的14.27%。采用线性回归计算得到SC-CO2法清除DPPH·自由基的IC50为3.173 3，而SD法无法计算。说明在保留胡椒木叶片精油中清除DPPH·自由基能力物质的稳定性方面，SC-CO2法优于SD法。
两种提取方法获得精油的还原力具有差异，SC-CO2法提取精油的还原力随精油浓度的增加呈增强趋势，而SD法增加不显著(图2B)。SC-CO2法提取精油的还原力在20 mg/mL达到对照Vc的34.86%，而SD获得的精油在20 mg/mL的还原力仅为对照的5.98%。说明，SC-CO2法对胡椒木中还原性物质的保护较好，而SD法对这类物质破坏较大。
无论在清除DPPH·自由基能力还是在还原性方面，SC-CO2法>溶剂萃取法[1]>SD法。说明SC-CO2法提取方法对胡椒木精油中酚类、萜类等还原性和抗氧化性物质的保留或萃取效果要优于SD法。
3 结 论
本文采用优化的SC-CO2法和SD法提取了胡椒木叶片精油并采用GC-MS分析，结合获得精油的抗氧化性测定，对两种提取工艺的成分进行了分析验证。结果显示，胡椒木精油含有多种驱虫、杀虫、抗菌等生物活性物质，但不同提取工艺的选择对获得胡椒木精油中活性成分具有一定差异，SC-CO2法对精油的天然成分破坏较少，保留了大量活性成分，且精油获得量较高，而SD法在温度控制、萃取溶剂等方面尚有较多缺陷，需进一步优化。另外，仅用精油获得量作为考察指标，具有一定的局限性。本文对开发以胡椒木为原料的绿色植物源农药提供了参考。
