基于UPLC-Q-Orbitrap MS法分析补肺益肾方的化学成分

黄海英,康俊丽,余亚辉,赵 鹏,冯素香,杜 燕,李建生，3*

(1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046;2.河南中医药大学 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046；3.河南中医药大学 河南省中医药防治呼吸病重点实验室，河南 郑州 450046)

补肺益肾方源于河南中医药大学第一附属医院的应用临床验方，由人参、黄芪、山茱萸、醋五味子、淫羊藿(炙)、浙贝母和陈皮等12味药组成，为临床有效方剂，具有补肺益肾、益气化痰、止咳平喘等功效。本课题组前期采用网络药理学结合药学实验研究发现，该复方可有效缓解慢性阻塞性肺炎(COPD)患者的肺功能下降，减少急性加重发作的次数和程度，改善肺功能[1-2]，其机制可能是调节信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STAT)STAT3和STAT5通路中辅助性T 细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡[3]。采用高效液相色谱(HPLC)法与细胞药效学相结合的方法进行研究后发现，该复方的主要有效成分为皂苷类、单萜类和黄酮醇类成分[4]，但由于其组成药物较多，全面了解该复方的化学成分，对于后续的药效物质基础发现具有积极作用。

高分辨率串联质谱(如Orbitrap技术)与线性离子阱的结合，可提供丰富的具有高分辨率和快速扫描速度的MSn信息(全扫描时每次扫描≤1 ms)，并提供高质量精度(误差小于5×10-6)，因此广泛用于各种化合物的结构解析。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap MS)结合了UPLC的高效分离能力和MS的强大结构表征能力，从而提供了快速、灵敏、可靠和高通量的平台，可广泛获得化合物结构相关的碎片离子，已用于中药复方的成分鉴定[5-6]。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS方法结合相关数据库对补肺益肾方进行化学成分分析，以阐明其药物化学成分，为该复方的药效物质基础、质量控制等研究提供数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Q-Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪、Xcalibur质谱工作站、Mass Frontier 6.0 软件、UltiMate3000高效液相色谱仪(Thermo Scientific公司)；Phenomenex kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；Milli-Q处理纯净水(美国Millipore公司)；KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo)。

超纯水(自制)；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，Fisher Scientific公司)；实验所用药物由国家中医临床研究基地河南中医药大学第一附属医院临床药理研究基地提供。

1.2 实验方法

1.2.1供试品溶液的制备取1.2 g补肺益肾颗粒于洁净干燥的具塞锥形瓶中，加入50%(体积分数)甲醇20 mL，称重。超声处理60 min，取出冷却至室温，以50%甲醇补足减失重，摇匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后，即得。

1.2.2色谱条件色谱系统:UPLC-Q-Orbitrap MS(Thermo Scientific公司)；色谱柱：Phenomenex kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流速：0.2 mL/min；柱温：25 ℃；流动相：A为1‰甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～2 min，5%B；2～5 min，5%～20%B；5～20 min，20%～25%B；20～23 min，25%～50%B；23～40 min，50%～100% B;进样量：5 μL。

1.2.3质谱条件电喷雾离子化源(ESI)，采用正、负离子模式分别进行检测；载气为氮气，鞘气压力3.5 MPa，辅助气流速3.3 L/min，喷雾电压3.50 kV，透镜电压 120 V。毛细管温度350 ℃，辅助气加热温度200 ℃，分辨率为70 000，扫描方式为全扫描，扫描范围:m/z100～1 500。

2 结果与讨论

2.1 补肺益肾方的化学成分

按照“1.2”实验条件对补肺益肾方进行质谱分析，分别得到正离子和负离子模式下的总离子流图(图1)。根据文献[7-35]检索建立补肺益肾方的化学成分数据库，应用仪器自带Xcalibur 3.2软件计算化合物的化学组成(误差小于5×10-6)，通过特征碎片离子峰、归属信息，应用Mass Frontier 6.0 工作站辅助推测功能并结合文献报道推断化学结构。通过质谱解析软件共鉴定出242个化学成分，其中负离子模式下鉴定37个成分，人参23个，黄芪14个(表1)；正离子模式下鉴定205个化学成分：其中人参10个，黄芪17个，赤芍28个，浙贝母9个，炒紫苏子63个，陈皮9个，矮地茶8个，酒萸肉7个，醋五味子26个，淫羊藿(炙)28个(表2)。

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M-H)Measured(M-H) Error(ppm) Fragment (m/z) SourceReference110.76C21H18O13槲皮素-3-O-glu477.067 5477.068 54.471477AR[7]212.01C48H82O19人参皂苷20-Glc-Rg1961.537 8961.535 3-1.4111 007,961GRR[8]314.40C42H72O14人参皂苷Rg1799.484 9799.484 00.209845,799GRR[8]414.44C44H70O15绵毛黄芪苷Ⅱ837.464 2837.461 5-1.908837AR[7]514.74C48H82O18人参皂苷Rd945.542 8945.542 30.590991,945GRR[8]618.81C15H10O6山奈酚285.040 5285.040 91.536331,285AR[7]720.38C51H84O21人参皂苷Malonyl-Rd1 031.543 21 031.542 60.4501 031GRR[8]824.03C44H70O15绵毛黄芪苷Ⅲ837.464 2837.461 0-2.505883,837AR[7]924.15C42H72O14人参皂苷Rf799.484 9799.484 50.834845,799GRR[8]1024.27C41H68O14黄芪甲苷783.453 6783.453 71.490829,783AR[7]1124.37C59H100O27人参皂苷Ra31 239.637 91 239.636 8-0.0191 285,1 239GRR[8]1224.45C54H92O23人参皂苷Rb11 107.595 71 107.591 7-0.0591 107,945,783,621,459GRR[8]1324.45C41H70O13三七皂苷R2769.474 4769.474 71.860769,815GRR[8]1424.48C42H72O13人参皂苷Rg2783.490 0783.486 5-3.087829,783GRR[8]1524.49C58H98O26人参皂苷Ra1,Ra21 209.627 41 209.626 50.1991 255,1 209GRR[8]1624.69C53H90O22人参皂苷Rc1 077.581 41 077.585 1-2.4131 123,1 077,945,915,783GRR[8]1724.74C57H94O26人参皂苷Malonyl-Rb11 193.595 31 193.596 10.2861 193GRR[8]1824.75C53H90O22人参皂苷Rb21 077.583 21 077.585 11.8001 123,1 077,945,915,783GRR[8]1924.80C53H90O22人参皂苷Rb31 077.582 01 077.585 11.7001 123,1 077,945,915,783GRR[8]2024.82C43H72O14人参皂苷Rg5811.184 9811.485 82.424811GRR[8]2124.85C49H80O19绵毛黄芪苷Ⅻ971.522 1971.521 90.920971AR[7]2224.86C55H92O23人参皂苷Rs1,Rs21 119.595 71 119.595 00.3881 165,1 119GRR[8]2324.86C56H92O25人参皂苷Malonyl-Rb2,malonyl-Rb3,malonyl-Rc1 163.585 51 163.585 10.6061 163GRR[8]2424.94C48H76O19人参皂苷Ro955.490 8955.489 90.203955GRR[8]2524.97C41H68O14异黄芪甲苷783.453 6783.453 91.745829,783AR[9]2625.06C48H82O18人参皂苷Re945.542 8945.542 81.119991,945GRR[10]2725.27C51H84O21人参皂苷Malonyl-Re1 031.543 21 031.543 51.3231 031GRR[10]2825.48C48H82O19人参皂苷20-Glc-Rf961.537 8961.536 6-0.059961GRR[10]2925.60C47H76O17黄芪皂苷Ⅷ911.501 0911.502 22.548957,911AR[7]3025.64C48H78O18大豆皂苷Ⅰ941.511 5941.514 03.779987,941AR[9]3125.64C48H78O18绵毛黄芪苷Ⅸ941.511 5941.512 92.611987,941AR[9]3226.02C43H72O14人参皂苷Rg6811.184 9811.486 22.917811GRR[10]3326.02C42H68O14绵毛黄芪苷Ⅴ/Ⅵ795.453 6795.454 92.976795AR[9]3426.76C42H72O13人参皂苷Rg3783.490 0783.488 5-0.534829,783GRR[10]3528.83C41H66O15黄芪皂苷Ⅱ797.432 9797.433 82.511797AR[9]3630.37C41H68O14黄芪皂苷Ⅲ783.453 6783.453 41.107829,783AR[9]3737.77C18H32O2亚油酸279.233 0279.233 14.452279AR[9]

*AR：Astragali Radix(黄芪)；GRR：Ginseng Radix Rhizoma(人参)

表2 正离子模式下的补肺益肾方化学组分Table 2 Identification of compounds in Bufei Yishen formula by UPLC-Q-Orbitrap MS in positive ion mode

(续表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference509.00C22H22O10毛蕊异黄酮苷447.128 6447.128 4-0.388285AR[9]519.07C11H16O3芍药苷降解物197.117 2197.117 2-0.106197,179,161,137,135,123,109PR[29]529.14C16H24O10脱苯甲酰芍药苷377.145 6377.145 22.59377,243,200,172PR[18]539.15C21H20O10阿福豆苷433.112 9433.112 9-0.054287EH[34]549.22C9H10O34-羟基苯甲酸乙酯167.070 3167.070 2-0.071167,149,125PR[16]559.30C27H43NO3浙贝酮430.331 6430.331 3-0.629430,412FTB[32]569.39C23H28O114-表-芍药内脂苷481.157 2481.157 40.051453,197,179,161,135PR[19]579.42C10H14对聚伞花素135.116 8135.116 7-0.94135,93PF[29]589.48C21H20O11三叶豆苷449.107 8449.107 1-0.438287EH[34]599.53C27H43NO3贝母素乙430.331 6430.331 5-0.164430,412FTB[32]609.60C21H20O12金丝桃苷465.102 8465.102 80.102303,153,127,109EH[34]619.68C7H6O5没食子酸171.028 8171.028 80.001171,153,135,127,125,109,107,81PR[15]629.70C17H14O7苜蓿素331.081 2331.081 1-0.39331EH[34]639.79C10H16O紫苏醇153.127 4153.127 3-0.092153,135,107PF[30]649.85C10H16O香叶醛153.127 4153.127 3-0.09297,135,153PF[29]6510.06C11H14O2甲基丁香酚179.106 7179.106 70.244179,151,137,117PF[30]6610.27C17H14O6熊竹素315.086 3315.085 3-3.22315AR[7]6710.32C12H14O5三甲氧基肉桂酸239.091 4239.091 2-0.837239,193PF[29]6810.42C16H12O7异鼠李素317.065 6317.065 60.066317AR[7]6910.43C27H32O14柚皮苷581.556 0581.535 00.012581,419CRP[12]7010.44C21H22O9柚皮素419.133 7419.133 70.099419CRP[12]7110.51C10H10O2四环-7-辛烯-4-羧酸甲酯163.075 4163.075 3-0.344163,131,103GRR[8]7210.68C19H32O7布卢门醇C葡糖苷373.222 1373.222 10.054135,109EH[34]7310.77C13H20O24-羟基-α-紫罗兰酮193.158 7193.158 70.042193,147,137,133,95,79PF[29]7410.78C30H32O15没食子酰芍药苷633.181 4633.180 6-0.791285,153,105PR[15]7510.80C15H14O6儿茶素291.086 3291.086 3-0.05291,245,165,153,149,127,121,109PR[15]7610.84C15H20α-去二氢菖蒲烯201.163 8201.163 5-1.378201,145,131,105,91AJH[23]7711.03C21H20O11木犀草素-7-氧-glu苷449.107 8449.107 6-0.53303,287,129,85PF[11]7811.06C21H20O11槲皮苷449.107 8449.107 1-1.643287EH[34]7911.06C15H10O7槲皮素303.049 9303.049 9-0.096303,165,153,137EH/PF/AR[34]8011.16C32H38O164-烃基-8-异戊烯基黄酮-7-O-葡萄糖679.223 3679.223 0-0.385355,85EH[34]8111.21C22H24O11橙皮素-7-O-葡萄糖465.139 1465.138 9-0.238303,179,163,153,123CRP[13]8211.40C28H32O14刺槐黄素-7-O-芸香苷593.186 5593.186 1-0.644269PF[11]8311.46C27H45NO2鄂贝啶碱416.352 3416.352 3-0.015416FTB[32]8411.98C12H16O3细辛脑209.117 2209.117 1-0.578209,181,173,139PF[30]8512.22C18H16O8迷迭香酸361.091 8361.091 4-1.091361,197,191,167,163,153,137,135PF[11]8612.25C27H45NO3异贝母素甲432.347 2432.347 0-0.511432,414FTB[32]8712.26C28H34O15橙皮苷611.197 0611.196 7-0.567369,303,153,129CRP[13]8813.25C15H16O4Calodendrolide261.112 1261.112 1-0.136261,243,177,159,105CF[27]8913.25C27H45NO2蒲贝素A及同分异构体416.352 3416.352 2-0.255416FTB[32]9013.37C22H22O9芒柄花苷431.133 7431.133 1-1.296269AR[22]9113.38C22H22O8苦鬼臼毒素415.138 7415.138 6-0.347415,373,295,181,135FTB[31]9213.56C27H43NO2浙贝丙素414.336 7414.336 1-1.342414FTB[32]9313.59C16H12O4芒柄花素269.080 8268.080 1-2.733269,107AR[7]9414.41C12H16O3异榄香素209.117 2209.116 7-2.491209,181,173,139PF[30]9514.52C36H60O8人参皂苷Rh4621.436 1621.435 1-1.602109,95,69GRR[10]9614.59C15H22芳-姜黄烯203.179 4203.179 50.358203,161,147,133,121,119,93,91AJH[23]9714.65C12H16O7熊果苷273.096 9273.096 5-1.389111PR[18]

(续表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference9814.70C15H181,4-二甲基-7-(1-甲基乙基 )-奥苷菊环199.148 1199.147 8-1.643199,157,91,81AJH[23]9914.87C10H16柠檬烯137.132 5137.132 4-0.562137,109,95,81,67PF[30]10014.88C8H8O43,4-二羟基苯甲酸甲酯169.049 5169.049 4-0.135169,151PF[29]10114.90C18H13N3O27β-羟基吴茱萸次碱304.108 1304.108 82.456304,221,158,143,136,130,117,103CF[27]10214.94C10H16右旋-α-蒎烯137.132 5137.132 50.167137,109,95,81SCF[19]10315.04C30H32O13苯甲酰氧化芍药苷601.191 6601.191 0-0.567121,105PR[15]10415.23C14H18O21,4-双(1-羟基环戊基)-1,3-丁二炔219.138 0219.138 00.199219,67GRR[8]10515.50C21H18O11芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷447.092 2477.092 1-0.196271PF[11]10615.74C10H16樟脑萜137.132 5137.132 50.167137,109,95SCF[19]10716.12C30H32O12Paeonivayin585.198 6585.193 83.47541,463,197PR[15]10816.43C30H26O14木犀草素-7-咖啡酰葡萄糖苷611.139 5611.139 5-0.032153,85PF[11]10917.06C26H30O11淫羊藿属苷C519.176 1519.186 10.023373EH[34]11017.19C22H24O7戈米辛 R401.159 5401.159 3-0.448383,341SCF[20]11117.45C16H24O8牡丹皮苷F345.154 4345.154 2-0.194345,299,285,181,165,153,125PR[15]11217.59C23H28O10黄芪异黄烷苷465.175 5465.175 0-1.125123,97AR[7]11317.60C17H18O5(3R) 8,2'-二羟基-7,4'-二甲氧基异黄烷303.122 7303.122 7-0.001193,149,123AR[25]11418.17C16H12O5毛蕊异黄酮285.075 8285.075 5-0.877285,253AR[9]11518.18C17H16O58-羟基-6,7-二甲氧基黄烷酮301.107 1301.106 9-0.499301,197,103PF[29]11618.48C15H24O斯巴醇221.190 0221.190 00.036221,203,163,147,135,121,109,107,105PF[20]11718.79C15H10O6木犀草素287.055 0287.055 0-0.051287,153PF[29]11819.45C12H16O3榄香素209.117 2209.117 2-0.1209,181,173,139PF[30]11921.33C38H48O19朝藿定B809.286 3809.285 7-0.686369,97EH[35]12022.47C27H30O11淫羊藿次苷Ⅰ531.186 1531.185 9-0.354369,313EH[34]12122.52C39H50O19朝藿定C823.301 9823.301 9-0.007369,129,111EH[35]12222.65C5H7NO3焦谷氨酸130.049 9130.050 11.771130,84PF[11]12322.94C33H40O15淫羊藿苷677.244 0677.244 00.005369,313,85,71EH[34]12423.27C33H40O15箭藿苷A(宝藿苷Ⅶ)677.244 0677.244 00.005369,313,85EH[34]12523.40C15H10O5芹菜素271.060 1271.059 9-0.738271,153,119PF/EH[29]12623.78C15H10O5大黄素271.060 1271.059 9-0.718271AR[25]12723.84C30H32O12苯甲酰芍药苷585.196 7585.196 80.252249,197,179,127,123,105,97,77PR[15]12823.91C27H32O11淫羊藿素-3-鼠李糖苷533.201 7533.201 7-0.072387,369,85EH[34]12923.95C30H32O12苯甲酰芍药内酯苷585.196 7585.196 70.081197,121,105,85PR[15]13024.10C18H34O5松油酸331.247 9331.247 3-1.813245,165,109,97,95PF[11]13124.14C16H12O6金圣草黄素301.070 7301.070 2-1.543301,269,153PF[29]13224.24C37H36O193',6'-二-O-没食子酰基芍药苷785.467 6785.468 2-0.742481,197,105PR[16]13324.26C10H14O紫苏烯151.111 7151.111 7-0.276151,123,109,95,93,81PF[30]13424.36C36H60O7人参皂苷Rh3605.441 2605.440 6-0.959123,109,107,95,85,81GRR[10]13524.57C16H12O6鼠李柠檬素301.070 0301.070 0-2.207301,269AR[7]13624.64C23H28O13S芍药苷亚硫酸酯545.132 3545.133 52.132441,243,175PR[15]13724.69C18H32O313-羟基-9,11-十八碳二烯酸297.242 4297.241 9-1.754279,261,125,123,109AR[7]13824.71C35H42O16箭藿苷C719.254 6719.252 9-2.31369,313,85EH[35]13924.73C20H20O8桔皮素389.123 1389.122 5-1.527389,359CRP[12]14024.74C15H24O环氧石竹烯221.190 0221.189 7-0.292221,203,175,161,147,133,121,109,107PF[30]

(续表2)

(续表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference18529.13C30H34O8苯甲酰戈米辛H523.232 6523.232 2-0.849105SCF[20]18629.51C15H26O法呢醇223.205 6223.205 6-0.042111,95,81PF[29]18729.79C10H12O2丁香酚165.091 0165.091 1-0.037165,147,137,123PF[30]18829.89C15H22O恰米醛219.174 3219.174 3-0.191219,163,135,123,109SCF[20]18930.19C23H26O7新异五加内脂素415.175 1415.175 1-0.071415SCF[20]19030.21C15H26O蓝桉醇223.205 6223.205 6-0.042147,121,111,109,107PF[29]19130.60C22H22O7宝藿素399.143 8399.143 8-0.074399,357EH[34]19230.81C23H30O6戈米辛 K1403.211 5403.211 5-0.038403,371SCF[20]19330.91C15H22菖蒲烯203.179 4203.179 50.358203,175,161,147,133,119,91AJH[23]19431.12C15H24白菖烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,121,109,107,105SCF[19]19531.22C22H24O6五味子丙素385.164 6385.164 60.091385,355SCF[27]19631.44C23H28O6五味子乙素(γ-五味子醇甲)401.195 9401.194 50.087401,369,165SCF[20]19731.53C30H32O9五味子酯甲537.211 9537.210 9-1.878367,105SCF[27]19831.63C15H22去氢白菖烯203.179 4203.179 50.358203,175,161,147,133,119,91PF[29]19932.47C17H24O人参炔醇/人参新萜醇245.190 0245.189 9-0.375245GRR[8]20032.52C15H241-石竹烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,123,121,109,107AJH/SCF[19]20132.52C15H28O2肉豆蔻脑酸甲酯241.216 2241.216 1-0.44297GRR[8]20233.12C15H24反-α-金合欢烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,121,109PF[30]20333.28C15H22O4,6,6-三甲基-2-(3-甲基-1,3-丁二烯基)-3-氧杂三环[5.1.0.0(2,4)]辛烷219.174 3219.174 40.265219,163,159,145,137,135,123GRR[8]20433.80C15H24O氧化石竹烯221.190 0221.189 9-0.416221,163,161,147,135,121,119,109AJH[23]20535.12C19H27NO1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹诺酮286.216 5286.216 5-0.143286,118SCF[27]

*PR：Paeoniae Rubra Radix(赤芍)；SCF ：Schisandrae Chinensis Fructus(醋五味子)；GRR：Ginseng Radix Rhizoma(人参)；CF：Corni Fructus(酒萸肉)；CRP：Citri Reticulatae Pericarpium(陈皮)；PF：Perillae Fructus(炒紫苏子)；EH：Epimedii Herba(淫羊藿(炙))；AJH：Ardisiae Japonicae Herba(矮地茶)；AR：Astragali Radix(黄芪)；FTB：Fritillariae Thunbergii Bulbus(浙贝母)

2.2 补肺益肾方主要化学成分的裂解规律

2.2.1皂苷类成分的裂解规律前期研究发现皂苷类成分在该复方中数量较多，但由于皂苷类成分在正离子模式下的MS响应较差，故采用负离子模式进行鉴别。在裂解过程中，分子离子峰多为丢失glu分子，这与报道一致[10]。以人参中的人参皂苷Rb1为例，UPLC-Q-Orbitrap MS测定的保留时间为24.45 min，准分子离子峰为m/z1 107.591 7[M-H]-，产生的特征二级离子碎片有m/z945.542 9、783.487 2、621.434 2、459.382 2；其中m/z1 107为 [M-H]-，m/z945为[M-glu-H]-，m/z783为[M-2glu-H]-，m/z621为[M-3glu-H]-，m/z459为[M-4glu-H]-，为人参皂苷Rb1的特征碎片；结合数据库及文献报道，该碎片与人参皂苷Rb1的理论裂解碎片相似度高，推测该结构为人参皂苷Rb1。人参皂苷Rb1的总离子流图、二级质谱解析及裂解途径见图2。

2.2.2芍药苷类成分的裂解规律芍药中多含单萜糖苷类化合物，通过对比数据库发现，裂解过程中易丢失1分子葡萄糖[M-162]+，同时母核上易丢失苯甲酸分子，留有1分子母核m/z197碎片，并同时形成m/z121碎片，该碎片进一步丢失1分子羟基，形成m/z105碎片[16]。以芍药苷为例，UPLC-Q-Orbitrap MS测定的保留时间为7.91 min，准分子离子峰为m/z481.169 9[M+H]+；其产生的特征二级离子碎片有m/z197.080 3、137.059 7、121.064 5、105.033 9；其中m/z197为[M+H-C7H5O-H2O-C6H11O6]+，m/z137为[M+H-C15H21O9]+，m/z105为[M+H-C16H23O9-H2O]+，为芍药苷的特征碎片；结合数据库及文献报道，该碎片与芍药苷的理论裂解碎片相似度高，推测该结构为芍药苷。芍药苷的总离子流图、二级质谱解析及裂解途径见图3。

图2 人参皂苷Rb1的总离子流图(A)、二级质谱裂解图(B)与裂解规律(C)Fig.2 TIC(A)，secondary mass spectrum(B) and proposed fragmentation pathways(C) of ginsenoside Rb1

图3 芍药苷的总离子流图(A)、二级质谱裂解图(B)与裂解规律(C)Fig.3 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of paeoniflorin

2.2.3生物碱类成分的裂解规律以浙贝母中贝母素甲为例，UPLC-Q-Orbitrap MS测定的保留时间为8.76 min，准分子离子峰为m/z432.346 7 [M+H]+，该分子易丢失小分子H2O，产生特征二级离子碎片[M+H-H2O]+，m/z414.335[32]；结合数据库及文献报道，该碎片与贝母素甲的理论裂解碎片相似度高，推测该结构为贝母素甲。贝母素甲的总离子流图、二级质谱解析及裂解规律见图4。

图4 贝母素甲的总离子流图(A)、二级质谱裂解图(B)与裂解规律(C)Fig.4 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of peimine

2.2.4黄酮醇类成分的裂解规律与数据库对比发现，该复方中的黄酮醇类成分检出较多。以黄酮苷为代表，其母核为黄酮醇类，8位上有异戊二烯基，MS数据显示，该分子易脱去2分子糖链形成m/z369碎片，为其基本母核，在此基础上脱去1分子异戊二烯基，形成m/z313碎片[35]。以淫羊藿苷为例，UPLC-Q-Orbitrap MS测定的保留时间为22.94 min，准分子离子峰为m/z677.244 0[M+H]+，其产生的特征二级离子碎片有m/z369.133 9、313.070 9、129.054 6；其中m/z369为[M+H-C6H10O5-C6H10O4]+，m/z313为[M+H-C6H10O5-C6H10O4-C4H8]+，为淫羊藿苷的特征碎片；结合数据库及文献报道，该碎片与淫羊藿苷的理论裂解碎片相似度高，推测该结构为淫羊藿苷。淫羊藿苷的总离子流图、二级质谱解析及裂解规律见图5。

2.2.5木质素类成分的裂解规律木质素由2分子苯丙素衍生物聚合而成，结构稳定，在能量攻击下易丢失小分子(如CO、H2O等)[20]。以醋五味子中五味子乙素为例，UPLC-Q-Orbitrap MS测定的保留时间为31.44 min，准分子离子峰为m/z401.194 5[M+H]+，其产生的特征二级离子碎片有m/z369.169 1，为[M+H-CH4O]+，是五味子乙素的特征碎片；结合数据库及文献报道，该碎片与五味子乙素的理论裂解碎片相似度高，推测该结构为五味子乙素。五味子乙素的总离子流图、二级质谱解析及裂解规律见图6。

补肺益肾方由人参、黄芪、赤芍、浙贝母、醋五味子、炒紫苏子、陈皮、淫羊藿(炙)、矮地茶、酒萸肉、枸杞、地龙12味中药组成。人参、黄芪中多含皂苷类成分，负离子模式测定的响应较高，负离子模式下共鉴定出37个成分，其中人参皂苷类23个，黄芪皂苷类11个；正离子模式下只鉴定出人参皂苷2个，黄芪皂苷2个成分。赤芍主要含有芍药苷和芍药内酯苷等单环倍半萜类成分，浙贝母主要含有生物碱类成分，醋五味子主要含有木质素类成分，陈皮、矮地茶、淫羊藿(炙)主要含有黄酮醇类成分，酒萸肉主要含有环烯醚萜类成分，均在正离子模式下响应较大，正离子模式下共鉴定出 205种成分。浙贝母、醋五味子、炒紫苏子、陈皮、淫羊藿(炙)、矮地茶、酒萸肉药材中的成分测定较为合理，对于今后的研究具有较高的参考价值。

图5 淫羊藿苷的总离子流图(A)、二级质谱裂解图(B)与裂解规律(C)Fig.5 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of icarrin

3 结 论

本研究应用UPLC-Q-Orbitrap MS法快速定性分析了补肺益肾方的主要化学成分，通过应用Xcalibur软件匹配元素组成(误差值<5×10-6)，Chem Spider数据库查找结构式，Mass Frontier 6.0软件对结构式裂解，比对测定的二级碎片与理论碎片的相似度进一步推测其可能的化学成分。该方法可行性强，结果可信度高，为补肺益肾方在血清中的药物化学研究提供了参考，对于该复方的药效物质基础研究具有较高的应用价值。