鸽新城疫病毒毒力致弱株的拯救及免疫原性分析

蒋艳玉，赵莎莎，孙娜娜，孙军峰，孔宪刚，刘胜旺，刘怀然

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病研究创新团队，黑龙江哈尔滨150069)

新城疫(Newcastle disease，ND)是严重威胁养禽业的病毒性传染病，其病原为新城疫病毒(NDV)。NDV可长期在鸽群中潜伏感染，应激条件下致发病，其临床症状与鸡相似，常见肠炎、下痢和神经症状，以嗜神经速发型多见，发病和死亡率受品种、日龄、应激、饲养条件等影响差别较大[1-3]。鸽源NDV与鸡NDV同属副黏病毒血清I型，但鸽NDV在进化上形成独立的分支：ClassII类基因Ⅵb型，与目前常用疫苗株(ClassII系基因Ⅰ、Ⅱ型)抗原性差异较大，因而现有疫苗对鸽群免疫效果不佳，导致鸽群普遍性的高带毒率和发病率[4-5]。因此需要根据鸽ND特点，研制基于基因Ⅵb型的鸽专用ND疫苗，有效保障鸽养殖业健康发展。

NDV毒力与其F蛋白裂解位点的氨基酸顺序和组成密切相关。基于反向遗传技术构建重组病毒株研究表明，La Sota F蛋白裂解位点氨基酸序列突变为强毒株相应位点，病毒毒力增强[6]；反之，将强毒株F蛋白裂解位点突变为La Sota相应位点，病毒株毒力相应由强毒变为弱毒[7-8]，据此构建的病毒株已经用于ND疫苗生产[8]。目前有多篇关于各NDV反向遗传技术研究报道，均用于基础研究，未见有致弱株用于疫苗应用的报道[9]。本研究在构建鸽NDV反向遗传操作平台基础上，将病毒F蛋白裂解位点突变为La Sota相应序列，构建和拯救毒力致弱的重组病毒并进行免疫原性评价，以获得免疫原性良好的鸽ND疫苗株。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料鸽NDV Pi/CH/LHLJ/110822(简称0822)株由本实验室分离并保存[10]，MDT=63 h，ICPI=1.19；重组痘病毒 vTF-3、稳定表达 T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞由步志高研究员惠赠[11]；pOLTV5转录载体由Peeters惠赠[12]；V4株辅助质粒由本实验室构建[12]；SPF鸡胚和鸡红细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；IN-FUSION试剂盒购自Clontech公司；pCI-neo载体购自 Invitrogen公司；LipofectamineTM2000、限制性内切酶、T4 DNA连接酶等均购自NEB公司；pUC18-F1-4由本实验室前期构建。

1.2 引物设计根据GenBank中NDV 0822株基因序列(JX486554)和pOLTV5载体序列，0822株和疫苗株La Sota序列，设计2对突变引物 FF1/FR1和FF2/FR2用于构建F裂解位点突变质粒pOLTV5-FCS。病毒株基因组鉴定所用的短片段扩增引物见文献[3]。引物由华大基因公司合成(表1)。

1.3 NDV 0822基因组F蛋白裂解位点突变转录载体的构建将pOLTV5载体用引物PV5F与PV5R扩增线性化后利用In-fusion试剂盒与用KpnⅠ和HindⅢ双酶切线性化的质粒PUC18-F1-4连接，构建以pOLTV5为载体的含0822基因组全长cDNA的转录载体pOLTV5-0822FL。利用引物FF1/FR1与FF2/FR2通过overlapping PCR对0822病毒株F基因进行点突变，将F蛋白裂解位点序列由112RRQKRF117突变为La Sota株的112GRQGRL117，扩增片段通过酶切位点亚克隆至同样酶切处理的pOLTV5-0822FL载体，筛选重组质粒并测序，阳性重组质粒命名为pOLTV5-0822FL-FCS。

表1 实验中用到的关键引物Table 1 Important primers in this study

1.4 病毒拯救及鉴定待BSR-T7/5细胞生长至80%～90%时，于6孔板内每孔加入重组痘病毒vTF-3 200 μL(约 103pfu)作用 1 h。将总量约 10 μg 上述转录质粒与 V4株辅助质粒 pCI-NP-K，pCI-P-K，pCI-L-K按照 4∶2∶1∶1比例混合，根据转染试剂 LipofectamineTM2000操作说明转染接种vTF-3的BsR-T7/5细胞，4 h～6 h后加入阿拉伯糖苷，换为5%血清的 DMEM；24 h后加入 TPCK；72 h后收取细胞液，反复冻融后取上清液接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，3 d后收取尿囊液以NDV阳性血清进行病毒的HA/HI试验。对HI阳性病毒提取RNA扩增其F基因和含有遗传标记部位的基因片段进行测序鉴定并分析，鉴定正确的拯救亲本病毒命名为r0822-21A，r0822-17A，F蛋白裂解位点突变的拯救病毒命名为r0822-FCS。

1.5 突变毒株的主要生物学特性和遗传稳定性测定病毒株r0822经CEF 3代饰斑纯化， r0822-FCS株经3代鸡胚有限稀释法纯化，分别进行SPF鸡胚扩繁，测定r0822和r0822-FCS病毒株对1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)、最小致死量，致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID50)和对CEF半数感染量(TCID50)。将r0822-FCS株在鸡胚连续传代20次，收集每一代的尿囊液检测HA，并用5、10、15、20代的鸡胚尿囊液进行 RT-PCR扩增病毒F基因和遗传标记位点，并测序后评价其遗传稳定性。

1.6 r0822-FCS对鸡的安全性评价将15只3日龄SPF雏鸡分成2组，第一组10只，滴鼻点眼接种r0822-FCS原倍尿囊液0.1 mL，第二组5只采用0.1 mL PBS滴鼻点眼作为对照。两组在相同条件下分别饲养、观察15 d，第7 d、10 d、14 d采血测定血清抗体HI效价。免疫后2周，用基因Ⅶ型鸡源强毒株NDV/HLJ/01/06株以106EID50/0.1 mL/只肌肉注射攻毒，记录SPF鸡发病死亡情况。

1.7 r0822-FCS病毒株接种SPF鸡的免疫效力测定将14日龄SPF鸡24只平均分为2组，经滴鼻点眼分别接种 105EID50和 106EID50的 r0822-FCS病毒液，另设空白对照6只，于接种后的 4 d、7 d、14 d采血清测抗体效价。

1.8 r0822-FCS病毒株灭活疫苗对SPF鸡免疫效力测定将15只20日龄SPF鸡分为2组，第一组10只，每只肌肉接种0.3 mL按常规方法制备的油佐剂灭活r0822-FCS疫苗；第二组5只SPF鸡接种0.3 mL PBS作为对照。2组在相同条件下分别饲养，每隔7 d采血检测HI抗体效价。

1.9 r0822与r0822-FCS病毒株基因组序列分析将r0822-21A、r0822-17A病毒株在CEF中连续纯化3代，每代次挑取3个～5个病毒蚀斑经CEF扩繁、提取RNA反转录后选用合适位置引物(含重组起始或终止位点)进行PCR扩增，PCR产物测序后比较各代次病毒蚀斑间序列情况。r0822-FCS病毒株则直接比较经鸡胚有限稀释纯化的1代、3代以及第7代病毒的L基因序列。对3株病毒测序结果进行分析比对。

2 结果

2.1 重组病毒的拯救及初步鉴定应用V4株辅助质粒拯救病毒，结果显示：r0822-21A和r0822-17A为亲本病毒基因组拯救病毒；r0822-FCS为F蛋白裂解位点突变基因组拯救病毒，测序显示r0822-FCS的F蛋白裂解位点已经突变为La Sota株相应序列，NheI遗传位点存在。

2.2 拯救病毒株的主要生物学特性NDV毒力致病指数测定结果显示，r0822-FCS的ICPI值由亲本病毒的1.19降低为0.08，MDT值由63 h升至168 h以上，表明F蛋白位点突变病毒株致病性降低，由中等毒力病毒株变为弱毒株。另外，r0822-FCS在鸡胚中的病毒复制滴度由亲本株的10-7.71Log10 EID50/0.1 mL降低至10-2.25Log10 EID50/0.1 mL，显示其与La Sota、V4等传统弱毒疫苗株相似的特征。r0822-21A和r0822-17A病毒株的MDT值与亲本病毒株相差不大，符合中等毒力株特征，2株病毒的鸡胚及CEF复制滴度稍低于亲本株。r0822-17A的ICPI值(0.55)与亲本病毒(1.19)相差较多，呈现弱毒株的 ICPI值特征(表 2)。

表2 NDV 0822株及其拯救病毒株主要生物学参数测定Table 2 The major biological characteristics of NDV0822 and its rescuing strains

2.3 重组病毒r0822-FCS病毒株遗传稳定性评价0822-FCS在鸡胚中连续传代，其第 5、10、15、20代病毒经扩增测序，其F蛋白裂解突变位点均稳定存在，表明病毒株遗传稳定性良好。

2.4 重组病毒r0822-FCS的安全性评价r0822-FCS原倍尿囊液接种3日龄SPF鸡后，在观察期内健康状况良好，表明病毒株安全性良好。与传统NDV弱毒株接种鸡抗体效价相比，r0822-FCS接种14 d抗体HI效价约3 log2，抗体滴度严重偏低，属于非正常现象。以基因Ⅶ型鸡源强毒株NDV/HLJ/01/06株攻毒后，发病率为72.72%(8/11)，死亡率为54.54%(6/11)，对照组全部死亡(5/5)(表3)，表明r0822-FCS对3日龄SPF鸡仅具有部分保护效果。

2.5 重组病毒r0822-FCS灭活疫苗对SPF鸡的免疫效果r0822-FCS病毒经灭活、乳化后免疫20日龄SPF鸡，试验结果显示14 d抗体HI效价可达(7.5±1.12)log2，21 d 达到(9.1±1)log2，表明该病毒灭活疫苗免疫SPF鸡后可刺激其产生高水平血清抗体。

表3 r0822-FCS毒株的安全性评价和免疫效力测定Table 3 The safety evaluation and immunogenicity measurement of NDV r0822-FCS strain in SPF chicken

2.6 拯救病毒的基因组序列测定分析经对3株拯救病毒进行全基因组序列测定分析，显示3株病毒L基因位置均出现不同长度的与亲本病毒株差异较大基因片段，序列分析显示这些片段与V4病毒株的L基因相应片段同源性较高，替换区域与V4的核酸、氨基酸差异均不超过 2个(表 4)。其中r0822-21A病毒株L基因仅在末尾的57个核酸片段与0822同源，其L基因几乎全被V4的L基因替换。r0822-21A、r0822-17A病毒株均经过3轮CEF蚀斑纯化，每代次选择3～5个蚀斑进行PCR产物(包含异常基因起始位点或终位点)测序，结果显示，所有蚀斑测序结果高度一致，表明2株病毒株高度纯化。r0822-FCS经过3次鸡胚有限稀释法纯化和20代继代，其第1、3、7代的L基因测序结果均一致。据此初步推测，本研究获得的L基因不同程度重组了V4基因的3株病毒，是由于亲本病毒基因组与来自V4株的L基因辅助质粒在细胞内拯救过程中发生了随机同源基因重组的结果。

表4 拯救毒株L基因阅读框架中重组基因片段大小及位置Table 4 Length and location of recombinant gene segments in L gene open reading frame for rescuing viruses

3 讨论

基于反向遗传技术制备的ND疫苗已经应用于市场[7,13]，在目前缺少鸽ND专用疫苗背景下，为应用该技术快速获得毒力致弱的鸽ND疫苗候选毒株，本研究选用的NDV 0822为鸽基因VIb型代表性病毒株[10]，毒力致病指数表明r0822-FCS已经由中等毒力变为弱毒。依照疫苗规程测定，r0822-FCS对3日龄SPF鸡安全性良好，但接种后7 d、14 d HI抗体很低(2Log2～3Log2)。最小免疫剂量实验中，r0822-FCS以105EID50/0.1 mL、106EID50/0.1 mL剂量滴鼻点眼接种14日龄SPF鸡，未能检测到抗体阳转。以上动物实验结果与ND常规弱毒疫苗相比偏差较大，当时未找到确切原因。鉴于r0822-FCS作为弱毒疫苗效果不佳，将其灭活免疫20日龄SPF鸡，14 d抗体HI效价即达7.5 log2，符合ND疫苗免疫特点。因鸽NDV强毒株为基因VI型，该基因型对鸡为中等毒力，所以本次实验未进行攻毒保护测定。

实验初期仅对拯救病毒进行血清学鉴定和F基因位点突变确认，后期基因组测序发现，r0822-21A、r0822-17A、r0822-FCS 3株病毒均在 L基因不同位点出现不同长度的与亲本病毒株差异较大，而与V4株同源性高的片段。鉴于拯救体系中使用了V4病毒株的辅助质粒，所以推测上述异常与辅助质粒具有相关性。用La Sota病毒株基因组转录质粒与V4辅助质粒拯救出La Sota病毒株，用本RT-PCR体系扩增，未发现L基因重组现象，可以排除质粒、引物污染；3株病毒均经过多轮CEF蚀斑或鸡胚有限稀释纯化，每代次蚀斑、病毒株的PCR产物(包含异常基因起始位点或终止位点)测序结果高度一致。V4株在CEF中增殖能力极弱，经多代蚀斑纯化后存活的可能性极小，可排除病毒不纯因素。r0822-FCS病毒株以较高剂量免疫SPF鸡未检测到抗体阳转，表明该病毒株在鸡体内复制能力极弱，同时说明未有V4病毒株污染。r0822-FCS与亲本病毒株0822差异主要在于F蛋白位点突变和L基因部分被V4株相应基因替换。根据目前研究报道，F蛋白裂解位点与病毒致病性相关，不会对病毒复制效率产生显著影响；而L基因是NDV复制的重要相关基因，r0822-FCS病毒株在鸡体表现出的与目前NDV病毒株明显差异的生物学特性，与其L基因的变化密切相关。结合以上分析推测：本次应用反向遗传获得的病毒株在拯救过程中与辅助质粒的L基因发生了随机同源重组。

单股负链RNA病毒自然条件下以点突变为主，尚未见到有关自然条件下基因重组病毒株的报道。实验条件下通过转染或共感染，分阶段的负链RNA病毒发生基因重组现象，见于汉坦病毒和A型流感病毒[14]；而单股负链RNA病毒基因重组发生于实验条件下的呼吸道合胞体病毒，2株缺陷型病毒共同感染细胞时，拯救出了一株重组病毒[15]，但极低的拯救效率提示自然条件下发生重组可能性微乎其微。具体到NDV重组现象，2008年前后有多篇文章基于序列分析、分离病毒测序方面的报道[16-18]引起争论和质疑。刘秀梵等分析指出，此前一些报道的基因重组病毒株，多系未对病毒纯化、体系污染的原因[19]。Rout等研究指出，拯救NDV应构建同源辅助质粒，以防止可能出现的异源基因重组[20]。实验条件下，众多NDV反向遗传研究中均使用异源病毒株辅助质粒，本实验室也曾将La Sota病毒株、基因型VII病型毒株用V4株辅助质粒拯救，均未发现基因重组现象。La Sota、V4活疫苗株应用的半个多世纪以来，分子流行病学研究也未发现其重组病毒出现，所以此次实验中发生的L基因重组属于实验条件下的偶发现象。具体到实验体系中具体何种因素导致这一现象？如此高几率的重组(3株拯救病毒均发现重组)，其机制和风险是什么？尚需很多后继研究工作分析。

根据规程规定，ND疫苗研究和评价的标准动物仍然是鸡，r0822-FCS病毒株作为灭活疫苗可在鸡体内刺激产生高滴度抗体。本研究也用鸽进行了动物实验，然而由于目前鸽群普遍携带NDV，筛选的阴性鸽在隔离器饲养、实验期间发生死亡、抗原、抗体阳转现象，导致实验数据无法采用。鸽子因其特殊生活习性，疾病净化较为困难，所以鸽ND疫苗研究应该借鉴其他研究者经验，直接在鸽群中应用灭活疫苗，采集大样本数据来说明问题。

综上所述，尽管r0822-FCS作为弱毒疫苗效果不佳，其仍然可以作为鸽ND灭活疫苗备选病毒株。本研究首次报道了反向遗传操作实验条件下，NDV基因组与辅助质粒之间发生了基因重组，且其L基因是决定病毒复制的关键基因。本研究此次报道实验条件下NDV发生基因重组的主要目的是想借此听取同行研究者意见，另外提醒在进行NDV反向遗传操作时，如使用异源辅助质粒，应注意是否有同样问题。