新疆维吾尔族及汉族脑梗死病人ALOX5AP基因rs4293222位点多态性比较分析

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脑梗死已成为目前严重危害人类健康的世界问题，动脉粥样硬化是缺血性卒中的主要病理过程，而炎症因子是促进动脉粥样硬化的重要因素，检测炎性因子可了解缺血性脑卒中发生的危险因素，进行针对性预防及治疗脑梗死，减少病人家庭及社会负担。

缺血性脑卒中是一种复杂的多因素疾病，其发病率随着高血压、吸烟和糖尿病等危险因素增加而增加。缺血性脑卒中主要由不同程度管腔狭窄及不稳定斑块脱落形成栓子导致。动脉粥样硬化是缺血性卒中的主要病理过程，炎症因子是促进动脉粥样硬化的重要因素，检测炎性因子可了解缺血性脑卒中发生的危险因素，针对性地预防及治疗脑梗死，减少病人家庭及社会的负担。动脉粥样硬化是长期慢性炎症性疾病，导致脑血管疾病的发病[1-2]。5-脂氧合酶激活蛋白(ALOXPAP)和5-脂氧合酶(5-LO)通路产物白三烯在动脉粥样硬化过程中可起到促进作用，其异常表达最终可导致脑血管疾病发生[3]。ALOXPAP基因的相关突变可能引起白三烯等物质分泌，因动脉血管闭塞形成缺血性脑卒中[4]。本研究观察ALOX5AP基因rs4293222位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关研究，初步探讨新疆维吾尔族及汉族脑梗死的ALOX5AP基因rs4293222位点多态性的差异性，从而了解民族间脑梗死的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月—2017年12月在新疆维吾尔自治区中医医院脑病治疗的维吾尔族和汉族脑梗死病人100例，其中汉族50例，维吾尔族50例。所有病人均完善头颅CT或MRI扫描，并经过脑病科至少两位主治以上医师临床诊断，评估明确诊断。纳入标准：诊断需符合第四届中国脑卒中学术大会缺血性脑卒中诊断要求；完善头颅CT平扫或MRI平扫检查；病人或授权委托人知情同意，并签署相关知情文件。排除标准：短暂性脑缺血发作、腔隙性脑梗死及溶栓病人；蛛网膜下腔出血、颅内占位等；血液病、动脉炎等所致的脑卒中；严重脏器疾病，如心脏疾病、酗酒、严重感染、严重肾功能不全、接受器官移植、阿尔茨海默病、免疫系统疾病、恶性肿瘤等；因身体植入钢板、钢钉、起搏器等医疗器械而不能完善头颅CT或MRI平扫，不能完善相关检查。

1.2 分组资料 维吾尔族脑梗死50例，男32例，女18例，年龄54岁～76岁(62.42岁±0.99岁)；汉族脑梗死50例，男27例，女23例，年龄52岁～70岁(62.54岁±0.71岁)。所有病人均签署知情同意书，且本研究已获得新疆维吾尔自治区中医医院伦理委员会审查通过。

1.3 研究方法 病人了解本研究基本情况后，严格按照纳入及排除标准，完善病人一般资料，如年龄、性别、民族、高血压等。抽取病人空腹静脉血5 mL，经初步离心后放置于-80 ℃冰箱里，等待DNA检测。

1.4 AOLX5AP基因检测

1.4.1 引物的设计及扩增(见表1)

表1 引物及引物序列

1.4.2 竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific，KASP PCR)实验过程

1.4.2.1 实验准备 准备DNA模板，将DNA模板稀释至终浓度为1 ng/μL。

1.4.2.2 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测流程 第一轮PCR：完成SNP识别；第二轮PCR：完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物；SNP荧光型号检测：通过检测FAM与HEX荧光，检测SNP位点碱基。

1.4.2.3 荧光定量PCR仪进行SNP分型检测 PCR反应程序结束后将样本置于ABI Q6中检测FAM及HEX荧光信号，检测程序为反应温度30 ℃，时间为1 min，收集荧光信号，仪器根据每个样本检测的荧光信号值自动分型，Homozygous为纯合子，Heterozygous为杂合子。

1.4.3 PCR直接测序验证KASP分型结果 随机挑选样本进行直接测序验证KASP分型结果。

2 结 果

2.1 汉族与维吾尔族病人临床资料比较(见表2)

2.2 DNA提取结果(见图1)

2.3 rs4293222位点分型图谱(见图2)

2.4 rs4293222位点测序峰图 首先对特异性引物进行PCR扩增，再通过直接测序方式得到相应的序列。详见图3。

2.5 维吾尔族和汉族脑梗死病人rs4293222位点基因型和等位基因频率比较(见表3)

表2 两组临床资料比较

图1 DNA提取电泳图

图2 rs4293222位点分型图谱

图3 rs4293222位点测序峰图

3 讨 论

脑梗死是神经科常见的疾病，病因复杂，受多种因素影响[5]。一般认为，高脂血症、高血压、吸烟、饮酒、糖尿病、肥胖及脑卒中家族史均为脑梗死的危险因素[6]。近几年随着分子生物学的发展，有关脑梗死与诸多基因多态性的相关性探讨日益受到重视[7]。

以往研究表明，炎症是动脉粥样硬化关键步骤的关键要素，为脑血管疾病的发病机制，包括ALOX5AP，这是由ALOX5AP基因编码，是白三烯生物合成的关键调节器(LTS)，导致其在脂肪沉积和动脉积累[8-9]。LTS引起白细胞激活和促进血管壁单核细胞黏附，这一过程在动脉粥样硬化和炎症性疾病的发病机制中起重要作用[10-11]。ALOX5AP基因与动脉粥样硬化及斑块发生发展具有明显相关性，其突变率可提高该病的发生[12]。

ALOX5AP基因在炎症过程中起着关键作用，白三烯是主要促炎因子，可促进单核细胞与血管内皮黏附，激活白细胞，同时增加血管通透性[13]。ALOX5AP基因某些位点产生的生物活性物质涉及多种心脑血管疾病发病[3，14-15]。国外临床研究结果提示，ALOX5AP基因参与动脉粥样硬化的病理生理过程，最终导致缺血性脑卒中[16]。与中国人口呈正相关ALOX5AP基因的某些位点与动脉粥样硬化形成有关[17]。ALOX5AP基因在动脉粥样硬化和炎症性疾病中起重要作用。

表3 两民族rs4293222位点基因型和等位基因频率比较 例(%)

本研究采用病例-对照研究方法，利用PCR聚合酶链反应和DNA基因测序法对100例脑梗死病人ALOX5AP基因rs4293222位点多态性的各基因型及等位基因频率多态性进行测定，比较新疆地区维吾尔族和汉族脑梗死病人不同基因型发生风险的情况，结果显示维吾尔族和汉族脑梗死病人性别、年龄、吸烟、高血压史、糖尿病史比较，差异无统计学意义(P>0.05)，高脂血症比较，差异有统计学意义(P<0.05)。维吾尔族人注重晚餐饮食，故其血脂、体重指数相对较高，而汉族高能量食物摄入较少，两民族间饮食生活环境具有明显相关，可对相关可控危险因素的指导提供数据支持。

本研究通过对维吾尔族和汉族rs4293222位点多态性进行测定，发现GG、GC、CC 3种基因型，进而分析两民族3种基因型频率和C、G等位基因频率分布情况，结果显示：两民族3种基因型总体分布差异无统计学意义(χ2=0.890，P=0.641)，C、G等位基因总体分布差异无统计学意义(χ2=0.739，P=0.390)。ALOX5AP基因rs4293222在缺血性中风易感性发挥重要作用[18]，本研究结果与其不一致，分析可能是种族之间的差异。由于本研究样本量有限，检测方法受到多因素影响，并存在地域差异，因此尚需扩大样本量进行新疆不同地区多中心临床试验研究，进一步分析ALOX5AP基因rs4293222、rs4360791多态性与缺血性脑卒中的相关性，以明确筛选缺血性脑卒中的早期指标，为预防和治疗提供思路。